蛋白酶体抑制剂诱导OVCAR3卵巢癌细胞自噬的机制研究

目的:研究蛋白酶体抑制剂诱导OVCAR3卵巢癌细胞的自噬中PI3K通路的作用。方法:MG1 3 2处理OVCAR3细胞后,光镜观察自噬泡的形成。多种蛋白酶体抑制剂处理OVCAR3细胞后,Western blot检测自噬特异性蛋白LC3的变化。PI3K抑制剂(渥曼青霉素与3-MA)联合多种蛋白酶体抑制剂处理OVCAR3细胞,Western blot检测LC3的变化。采用shRNA技术下调OVCAR3细胞的Beclin 1表达,MG132处理细胞,Western blot检测LC3的变化,吖啶橙(AO)染色观察酸性自噬泡的形成。结果:MG132诱导OVCAR3卵巢癌细胞自噬泡形成,多种蛋白酶体抑制剂均可诱导OVCAR3细胞LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化增强。PI3 K抑制剂与蛋白酶体抑制剂联合应用,与单独应用蛋白酶体抑制剂相比,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化无改变。下调Beclin 1表达后,MG132诱导的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化及酸性自噬泡的形成均无改变。结论:蛋白酶体抑制剂诱导OVCAR3卵巢癌细胞发生自噬是不依赖PI3K途径进行的。     

PI3K在MG132诱导卵巢癌细胞自噬中作用的研究

目的:研究PI3K通路在蛋白酶体抑制剂MG132诱导卵巢癌细胞自噬中的作用。方法:MG132处理多种卵巢癌细胞(SKOV3、OVCAR3、A2870)后,光镜观察胞质内囊泡的形成,吖啶橙(AO)染色观察酸性囊泡的形成,Western blot检测自噬特异性蛋白LC3的变化。PI3K抑制剂(渥曼青霉素与3-MA)联合MG132处理多种卵巢癌细胞后,AO染色及West-ern blot检测自噬的变化。采用shRNA技术下调OVCAR3细胞的Beclin 1表达,MG132处理细胞,AO染色观察酸性囊泡的形成。结果:在多种卵巢癌细胞系中,MG132可诱导酸性囊泡形成及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化增强,PI3K抑制剂与MG132联合应用与单独应用MG132相比自噬水平无改变。下调卵巢癌细胞中Beclin 1表达后,MG132诱导的囊泡形成无改变。结论:MG132通过PI3K非依赖性途径诱导多种卵巢癌细胞发生自噬。     

Bcl-2相关抗凋亡基因3对蛋白酶体抑制剂抗肿瘤作用影响的观察

目的:探讨Bcl-2相关抗凋亡基因3(Bcl-2-associated athanogene 3, BAG3)在蛋白酶体抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡中的作用.方法: 选取不同组织来源的人肿瘤细胞系,分别设空白对照组、蛋白酶体抑制剂MG132处理组、衣霉素处理组及特异性siBAG3、随机序列核酸siRNA和错位型siBAG3组;利用实时定量RT-PCR法检测各组细胞BAG3及葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78) mRNA表达;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡.结果:与空白对照组相比,MG132能显著增加有关细胞BAG3基因表达水平(P<0.01);而衣霉素处理组细胞BAG3表达变化差异无统计学意义,P>0.05,但明显增加GRP78表达(P<0.01);siBAG3组细胞BAG3表达水平显著低于随机序列核酸siRNA和simutBAG3组(P<0.01),siBAG3组细胞凋亡率差异有统计学意义 ,P<0.01.结论:BAG3是影响蛋白酶体抑制剂凋亡效应的一类破坏因子,下调其表达有望增加蛋白酶体抑制剂抗肿瘤活性.     

MG132联合自噬抑制剂对A2870卵巢癌细胞抗肿瘤效应的研究

目的:研究蛋白酶体抑制剂MG132联合自噬抑制剂对A2870卵巢癌细胞的毒性作用。方法:不同浓度蛋白酶体抑制剂MG132处理A2870细胞,MTT及Hoechst33258核染色方法检测细胞的存活率及凋亡形态学改变;吖啶橙(AO)染色和蛋白质印迹法检测酸性自噬泡的形成及自噬特异性蛋白LC3的变化。多种自噬抑制剂联合MG132处理后,MTT法检测细胞的存活率。结果:与空白对照组比较,1、2、5和10μmol/L浓度的MG132作用24 h均能明显抑制A2870细胞的生长,细胞存活率分别为(84.38±0.53)%、(65.86±2.34)%、(54.63±2.36)%和(52.16±1.27)%,P值均<0.05;同时,5μmol/L的MG132处理后,A2870细胞出现染色质浓缩和核碎片等凋亡特征性形态学改变,且细胞内酸性囊泡细胞器明显蓄积;不同浓度MG132处理细胞,蛋白质印迹法证实,1μmol/L MG132即明显增加A2870细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达,且随MG132浓度增加,LC3-Ⅱ表达呈剂量依赖性增加。与MG132单独作用后A2870细胞存活率(58.32±1.46)%比较,早期自噬抑制剂3-MA和渥曼青霉素能显著增强MG132抑制A2870细胞的增殖作用,细胞存活率分别为(43.40±2.02)%和(45.35±2.27)%,P值均<0.05。晚期自噬抑制剂巴佛洛霉素和氯喹则无增强作用,细胞存活率分别为(58.11±2.70)%和(56.76±1.15)%,P值分别为0.558和0.667。结论:蛋白酶体抑制剂MG132抑制A2870卵巢癌细胞增殖并诱导自噬。早期自噬抑制剂能增加MG132抗A2870卵巢癌细胞的作用,而晚期自噬抑制剂无明显作用。     

LC3B真核表达载体构建及其在293细胞的表达

目的:构建重组人LC3B的真核表达载体,建立稳定表达EGFP、EGFP-LC3B的293细胞系.方法:基因克隆方法构建pcDNA3-N-EGFP-LC3B的真核表达载体,应用脂质体介导的转染技术将该重组质粒及pcDNA3-N-EGFP空载体质粒导入293细胞,用G418筛选稳定表达的细胞系.293细胞中EGFP、EGFP-LC3B的表达用倒置荧光显微镜方法检测.结果:成功扩增LC3B基因大小片段,克降测序结果与NCBI收录的LC3B序列完全一致.获得转染并经G418反复筛选稳定表达EGFP、EGFP-LC3B的293细胞系.结论:成功建立EGFP、EGFP-LC3B稳定表达的293细胞系,并且具有正常的生物学功能,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型.     

线粒体激酶PINK1的功能及其在神经退行性疾病与肿瘤中作用的研究进展

PINK1是一种线粒体丝苏氨酸蛋白激酶,其在氧化应激诱导的线粒体功能失调中起保护性作用.线粒体膜电位去极化时,PINK1募集parkin蛋白诱导线粒体自噬.生理状态下,PINK1在线粒体中被剪切并释放入胞质促进神经元分化.PINK1突变能够导致常染色体隐性早发帕金森病.在非神经退行性疾病中,PINK1通过激活胞质AKT信号通路、与线粒体抗凋亡蛋白Bcl-XL相互作用等机制,调节神经胶质瘤、乳腺癌等肿瘤细胞的生长与凋亡.本文对PINK1的生理功能及其在神经退行性疾病和肿瘤发生过程中的作用进行综述.     

过氧化物还原酶1对蛋白酶体抑制剂诱导未分化甲状腺癌FRO细胞凋亡作用的研究

目的:探讨蛋白酶体抑制剂对未分化甲状腺癌FRO细胞中过氧化物还原酶1(Prx1)表达的影响,以及Prx1在蛋白酶体抑制剂诱导FRO细胞凋亡中的作用.方法:选取人甲状腺未分化癌细胞系FRO,分别设培养液处理空白对照组,蛋白酶体抑制剂MG132、PSI、Lactacystin处理组;利用RNA干扰技术降低Prx1的表达;实时定量RT-PCR法、蛋白质印迹法分别检测各组细胞Prx1 mRNA及蛋白表达;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率.结果:与空白对照组相比,蛋白酶体抑制剂MG132、PSI和Lactacystin均显著增加FRO细胞系中Prx1基因表达水平(P<0.01);与空白对照组和随机序列核酸siRNA组相比,siPrx1处理组中Prx1 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.01),其凋亡率显著增加(P<0.01).结论:蛋白酶体抑制剂能够上调甲状腺未分化癌FRO细胞系中Prx1基因的表达水平,siPrx1具有特异性降低Prx1基因表达的作用,同时增加蛋白酶体抑制剂诱导甲状腺癌FRO细胞凋亡作用.     

白藜芦醇对MG132诱导K562细胞凋亡影响的研究

目的:研究白藜芦醇能否增加K562细胞对MG132的敏感性.方法:MG132单独及联合白藜芦醇作用于K562细胞,MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测PARP剪切水平.结果:＞50 μmol/L白藜芦醇能够有效地抑制K562细胞的活力,P＜0.01;MG132单独处理K562细胞24 h,对细胞活力的抑制呈剂量依赖性,P＜0.01;而联合用药时,白藜芦醇呈剂量依赖性的对抗了MG132对K562细胞的毒性,并且5μmol/L白藜芦醇有效的降低了K562细胞凋亡率,P＜0.05.结论:白藜芦醇具有对抗MG132诱导细胞毒性的潜在作用.     

3-甲基腺嘌呤对蛋白酶体抑制剂MG132抗卵巢癌A2870细胞作用的影响

目的:研究PI3K通路自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对蛋白酶体抑制剂MG132抗卵巢癌A2870细胞作用的影响。方法:不同浓度MG132处理A2870细胞后,MTT法及Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞的生存率及凋亡改变,吖啶橙(AO)染色和Western-Blot法检测酸性自噬泡的形成及自噬特异性蛋白LC3的变化。3-MA联合MG132处理A2870细胞,MTT法检测细胞的生存率,AO染色和Western blot法检测自噬的改变。结果:MG132可诱导A2870卵巢癌细胞发生增殖抑制及凋亡,同时,酸性自噬泡形成及LC3-I向LC3-Ⅱ的转化增强。而3-MA联合MG132明显降低A2870细胞的生存率,但不改变MG132诱导的A2870细胞的自噬水平。结论:3-MA对MG132抗A2870卵巢癌细胞的增强作用与自噬无关。MG132诱导A2870细胞发生的自噬与PI3K通路无关。     

胰腺癌细胞凋亡伴随胱天蛋白酶依赖性BAG3蛋白剪切的研究

目的:前期研究表明,蛋白酶体抑制剂诱导甲状腺癌细胞凋亡时伴随抗凋亡蛋白BAG3的剪切。本研究探讨BAG3蛋白剪切是否为细胞凋亡伴随的普遍现象。方法:选取人胰腺癌细胞SW1990和PANC1,分别设培养液处理空白对照组、蛋白酶体抑制剂MG132单独或与z-VAD联合处理组、星形孢菌素(STS)单独或与z-VAD联合处理组、依托泊苷单独或与z-VAD联合处理组、TNFα单独或与z-VAD联合处理组以及紫外线单独照射或与z-VAD联合处理组;利用蛋白质印迹法检测各组细胞中BAG3蛋白的剪切情况;利用流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率。结果:与甲状腺癌细胞类似,蛋白酶体抑制剂MG132诱导胰腺癌细胞凋亡的同时,伴随BAG3蛋白的剪切;其他凋亡诱导剂如依托泊苷、星形孢菌素和紫外线照射在诱导胰腺癌细胞凋亡的同时,也可诱导BAG3蛋白剪切体的出现;而广谱胱天蛋白酶抑制剂z-VAD可以完全抑制BAG3蛋白的剪切。结论:胱天蛋白酶依赖性BAG3蛋白的剪切可能是细胞凋亡时的普遍现象,BAG3可能为胱天蛋白酶作用底物。