复肝丸调控miR-424表达抑制肝窦内皮细胞血管新生的体外研究

目的观察复肝丸调控miR-424表达以抑制肝窦内皮细胞血管新生的作用及其机制。方法以不同剂量(0～2 000 mg/L)的复肝丸与人肝窦内皮细胞(HHSEC)共孵育,CCK8法检测复肝丸对细胞活力的影响,分析复肝丸对细胞无毒性作用的剂量范围,并以此作为后续药效及机制评价的剂量。以CoCl_2诱导HHSEC血管新生模型,分为正常组、模型组、miR-424抑制剂组及复肝丸组,除正常组外,其余各组以CoCl_2诱导细胞血管新生,miR-424抑制剂组及复肝丸组分别以miR-424抑制剂及复肝丸(200 mg/L)与细胞共孵育24 h。采用CCK8法检测细胞活力与增殖情况;Transwell观察细胞迁移变化情况;Matrigel管腔生成实验评价细胞管腔形成情况;定量RT-PCR检测miR-424、HIF-1α、vWF、CD31基因表达;Western blot法检测HIF-1α、vWF、CD31蛋白表达。结果复肝丸剂量小于400 mg/L对HHSCE无明显细胞毒性。与正常组比较,200μmol/L CoCl_2可诱导肝窦内皮细胞缺氧损伤模型,且模型组miR-424、HIF-1α表达增加,细胞迁移和管腔生成增多,vWF、CD31表达增加(P0.01);与模型组比较,miR-424抑制剂与200 mg/L复肝丸干预后,miR-424与HIF-1α表达均不同程度降低,细胞迁移和管腔生成受抑制,vWF、CD31表达降低(P0.01);且复肝丸组综合疗效与miR-424抑制剂相当。结论复肝丸具有良好的抑制肝窦内皮细胞血管新生的作用,其作用机制与抑制miR-424表达相关。     

以线粒体为靶点筛选中药抗肝毒性的活性成分研究思路与方法

肝脏是药物代谢的主要场所,肝细胞线粒体是药物肝损伤的重要靶标,线粒体自噬可以维持细胞内线粒体的健康运转以及细胞的稳定增殖,因此利用线粒体自噬来清除受损线粒体是抗药物性肝损伤的重要策略。多种中药中含有可以增强线粒体自噬的活性成分,可以调节线粒体自噬从而缓解相关疾病。但如何准确高效地从中药中发现并评价此类对线粒体有靶向活性成分的研究方法鲜有报道。而采用液质联用技术,以体内过程结合血清药理学的方法能准确、高效地锁定作用于线粒体靶点的中药活性成分。该文综述了增加线粒体自噬解药物肝毒性的中药成分研究思路与方法,为以线粒体为靶点的中药活性成分研究提供新思路与方法。     

扶正化瘀组分复方抑制血管新生的抗肝纤维化作用机制

目的:本研究旨在探讨扶正化瘀组分复方的抗肝纤维化作用及其作用机制。方法:采用DMN诱导小鼠肝纤维化模型,以扶正化瘀方为阳性对照。以天狼猩红染色和羟脯氨酸含量评估肝纤维化程度;肝脏微血管成像和CD31标记微血管密度评价肝脏血管新生;western blot法检测肝组织VEGF-R2表达;通过计数转基因斑马鱼功能性节间血管数和碱性磷酸酶活性验证药物对血管的影响。结果:扶正化瘀组分复方可显著改善纤维化小鼠血清肝功能(P<0.01):减少肝组织胶原沉积(P<0.01);减少肝脏微血管数量(P<0.01);下调VEGFR2蛋白表达(P<0.01);抑制斑马鱼碱性磷酸酶活性。结论:扶正化瘀组分复方具有抑制DMN诱导小鼠肝纤维化模型肝组织纤维化的作用,其作用机制可能与抑制血管新生有关。     

消胀贴膏外敷对小鼠肝硬化腹水的消退作用及对腹腔血管通透性的影响

目的评价消胀贴膏外敷对实验性肝硬化腹水的药效作用,探讨其影响腹腔血管通透性的作用机制。方法以二甲基亚硝胺(DMN)腹腔注射,药效评价实验模型动物随机分为模型对照组、安慰剂对照组、消胀贴膏低、中、高剂量组共5组,机制实验分为模型对照组、消胀贴膏中剂量组共2组,均设正常对照组。消胀贴膏组脐部外敷消胀贴膏,安慰剂对照组脐部外敷空白贴膏,每日1贴,共7d,模型对照组不敷贴任何药物。称量或测量模型动物的腹水量、腹围、体重,HE与天狼星红染色观察肝组织炎症与纤维化,生化检测血清ALT活性和Alb、TBil与一氧化氮(NO)含量,蛋白质印迹法分析肝组织血管内皮生长因子(VEGF)表达水平,通过测定小鼠腹腔积液及肝组织中渗漏伊文氏蓝(EB)含量的方法检测动物腹腔血管通透性。结果敷药前,各组模型动物的腹围、体重等基线资料一致。给药结束,与正常组比较,模型对照组小鼠的体重、腹围、腹水、腹水体重比等明显增加,腹腔积液及肝组织中渗漏EB含量明显增多,血清NO浓度及肝组织中VEGF蛋白表达明显增加。与模型对照组比较,安慰剂对照组的腹水量、腹围与体重等无明显改变。与安慰剂对照组比较,消胀贴膏中、高剂量组的腹水量、腹水体重比值明显下降,高剂量组的腹围、体重也明显下降;高剂量组与低剂量组比较,腹围、体重明显下降。各剂量消胀贴膏对肝功能及肝组织病理均无明显影响。与模型对照组比较,中剂量消胀贴膏组小鼠腹腔积液中渗漏EB含量降低,血清NO浓度及肝组织中VEGF蛋白表达明显减少。结论消胀贴膏明显减少肝硬化腹水模型动物的腹水量,中剂量(0.25 cm2消胀贴膏,652.9 mg生药/kg小鼠)开始发挥药效,其部分机制在于下调肝硬化腹水模型动物的肝组织VEGF表达、降低血清NO含量,从而抑制其异常增强的腹腔血管通透性。     

扶正化瘀方影响转化生长因子β1/Smad信号通路的抗肝纤维化作用机制

目的：探讨扶正化瘀方影响转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）/Smad信号转导的抗肝纤维化作用机制。方法：本研究分体内实验和体外实验两部分。在体内实验中,37只雄性Wistar大鼠分为正常组（5只）、模型组（18只）和扶正化瘀方组（14只）。模型组和扶正化瘀组大鼠采用二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine,DMN）腹腔注射复制大鼠肝纤维化模型。灌胃治疗4周后,采用盐酸水解法检测肝组织中羟脯氨酸（hydroxyproline,Hyp）含量,蛋白质印迹法分析肝组织中TGF-β1、TGF-β1Ⅰ型受体（TGF-β1 type Ⅰ receptor,TβR-Ⅰ）、Smad2、Smad3及磷酸化Smad2/3蛋白的表达。体外实验采用培养4d的原代大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）,分为对照组、TGF-β1组、10%扶正化瘀方药物血清组及TβR-Ⅰ胞内激酶抑制剂（SB-431542）组。后3组用2.5ng/mLTGF-β1刺激24h后,对照组及TGF-β1组加10%正常大鼠血清,10%扶正化瘀方药物血清组加10%服用扶正化瘀方的大鼠血清,SB-431542组加10%正常大鼠血清及10μmol/LSB-431542。共孵育24h后,免疫荧光染色检测HSC中α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和Smad3蛋白的表达,蛋白质印迹法分析HSC中α-SMA蛋白的表达。结果：体内实验发现,扶正化瘀方可明显降低纤维化肝组织中异常升高的Hyp含量及TGF-β1、TβR-Ⅰ、磷酸化Smad2/3蛋白的表达。体外研究发现,正常HSC中α-SMA、TβR-Ⅰ表达较低,TGF-β1刺激可显著上调其表达;扶正化瘀方药物血清共孵育后,可明显抑制TGF-β1诱导的HSC中α-SMA的表达;正常HSCSmad3主要表达在细胞质中,细胞核中表达较低,TGF-β1可显著刺激Smad3向细胞核转移,扶正化瘀方药物血清可明显抑制TGF-β1诱导的Smad3核转位。结论：扶正化瘀方可下调纤维化大鼠肝脏及HSC中的TGF-β1/Smad病理信号转导通路,这可能是扶正化瘀方抗肝纤维化的部分作用机制。     

深圳地区308例小儿病毒性肝炎血清病原学调查

为了解深圳市小儿病毒性肝炎患者中甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎及TTV感染状况及分布特点,我们对收治的308例小儿病毒性肝炎病例进行血清病原学研究。 1 对象与方法 308例小儿病毒性肝炎系1998年1月～2001年4月我院收治的患者,其中男性183例,女性125例,年龄7个月～14岁,平均7.9±3.4岁。临床及血清病原学分型诊断标准,按1995年第5次全国传染病寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准,排除其他病毒如巨细胞病毒、EB病毒等引起的肝     

肝纤维化过程中整合素α5β1动态变化与扶正化瘀方干预作用

目的 探讨肝纤维化形成过程中整合素α5β1蛋白的变化特点,及其扶正化瘀方影响该蛋白表达的抗肝纤维化作用机制。方法 四氯化碳(CCl4)皮下注射与高脂低蛋白饲料复合建立大鼠肝纤维化模型。135只大鼠分为正常组、模型组与扶正化瘀方药物干预组。模型组又分为2d、1、2、3、4、5、6周共7个动态观察点。药物组自造模之日起以扶正化瘀方稀释液灌胃,共用药6周。其余大鼠灌以等量生理盐水。天狼猩红染色观察肝组织胶原沉积,盐酸水解法测定肝组织羟脯氨酸含量,Western印迹法分析肝组织纤维连接蛋白(FN)、α5β1与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达量,并分析其相关性。结果 随肝纤维化形成,模型组大鼠肝组织FN、α5β1与α-SMA蛋白表达量逐渐上升,早期以FN升高明显,而后以α5β1及α-SMA增加较为显著,三者之间呈明显正相关。与模型组比较,扶正化瘀方预防组大鼠肝脏胶原沉积减轻,肝羟脯氨酸含量下降。FN、α5β1与α-SMA蛋白表达减少。结论 CCl4大鼠肝纤维化形成中肝脏整合素α5β1表达逐渐增加,肝损伤早期FN显著上升,并可通过α5β1促进肝星状细胞活化与肝纤维化。扶正化瘀方抑制肝纤维化大鼠肝脏FN与整合素α5β1表达,该作用为扶正化瘀方抗肝纤维化机制之一。     

扶正化瘀方抗大鼠肾间质纤维化的作用

目的观察扶正化瘀方抗氯化汞(HgCl_2)诱导的大鼠肾间质纤维化病变的作用,并初步探讨其作用机制。方法将大鼠随机分为正常组、模型组、扶正化瘀方(FZHY)组及维生素E(VitE)组,模型组用HgCl_2 8 mg/kg灌胃9周,FZHY组(4.6 g/kg)和VitE组(100 mg/kg)分别给予相应的药物干预。检测肾功能情况(Cr和BUN),盐酸水解法检测肾组织羟脯氨酸(Hyp)含量,HE染色、Masson染色和六胺银(PASM)染色观察肾组织病理形态,Western blot观察Ⅰ型胶原(ColⅠ)、纤维连接蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果与模型组比较,FZHY组及VitE组大鼠肾体比(双肾质量/体重)明显下降(P0.05)、肾组织Hyp含量明显下降(P0.05),血清Cr和BUN含量明显下降(P0.01),肾脏纤维化程度明显减轻。其中FZHY组比VitE组轻。FZHY组和VitE组肾组织ColⅠ和FN表达均较模型组减弱(ColⅠ,P0.05;FN,P0.01)。FZHY组α-SMA表达较模型组减弱(P0.01),VitE组则无明显变化(P0.05)。结论FZHY可改善HgCl_2诱导模型大鼠的肾功能损伤,减少细胞外基质沉积,减轻肾间质纤维化病变,其作用机制与抑制肌成纤维细胞活化有关。     

转化生长因子β_1与肝纤维化

肝纤维化的形成过程是致病因素(如病毒、寄生虫感染、毒物等)导致肝细胞变性、坏死及炎症反应,激活枯否氏细胞释放一些促纤维化因子(如TGF-β_1等),随同血小板、肝窦内皮细胞和肝细胞等分泌的多种细胞因子,与某些化学介质共同作用于肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell.HSC)致使HSC激活,转化为肌成纤维细胞,通过旁分泌或自分泌作用,使HSC增殖、合成大量的细胞外基质(extracellular matrix.ECM)。另     

胆淤方对胆汁淤积小鼠胆汁酸代谢的影响

目的 探讨胆淤方对1,4-二氢-2,4,6-三甲基-3,5-吡啶二甲酸二乙酯（DDC）诱导胆汁淤积小鼠血清胆汁酸代谢的影响。方法 40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组：对照（N）组、DDC模型（M）组、奥贝胆酸（O）组、胆淤方（D）组,每组10只。N组小鼠用普通饲料喂养,M、O和D组小鼠用DDC饲料喂养,连续6周。造模第3周开始药物干预,O组ig予奥贝胆酸溶液（0.03 g·kg^-1）,D组ig予胆淤方药液（33 g·kg^-1）,M组和N组予相同体积的双蒸水。干预4周,收集小鼠血清和肝组织,试剂盒检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）和总胆汁酸（TBA）水平,HE染色观察肝组织炎症反应,CK19染色观察细胆管增生反应,天狼腥红染色观察纤维化,采用液质联用技术检测血清胆汁酸谱。结果 O组和D组ALT、AST、ALP、TBA、TBIL水平均较M组显著下降（P＜0.05）;D组ALT、AST水平较O组显著下降（P＜0.05）。D组小鼠肝组织炎症反应、纤维化及细胆管增生较M组减轻。D组血清初级胆汁酸胆酸（CA）和ω-鼠胆酸（ω-MCA）水平均较M组显著下降（P＜0.001）;D组血清次级胆汁酸甘氨胆酸（GCA）、牛磺胆酸（TCA）、牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）、牛磺去氧胆酸（TDCA）、牛磺猪去氧胆酸（THDCA）较M组显著下降（P＜0.05、0.01、0.001）,O组的CA、ω-MCA、TCDCA、GCA和TCA水平较M组显著下降（P＜0.001）,D组血清TUDCA水平较O组下降更加显著（P＜0.05）。热图分析显示13种胆汁酸可将M与N组、O与M组、D与M组、D与O组血清胆汁酸谱两两区分。结论 胆淤方可改善肝内炎症反应,具有广泛的降胆汁酸作用。