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1.
目的:通过csgRNA策略降低APOBECs蛋白对Cas9-D10A/sgRNA系统进行基因编辑时产生的突变。方法:针对Cas9-D10A/sgRNA4 和Cas9-D10A/sgFANCF打靶位点的非切割链设计csgRNA并对csgRNA的碱基长度和空间结合位置进行精细优化,在293FT-APOBEC3B过表达细胞系检测基因突变效率。结果:与对照组比,在sgRNA4和sgFANCF打靶位点上,csgRNA明显降低Cas9-D10A进行基因编辑时产生的切割条带;通过对csgRNA条件优化,发现当csgRNA长度为16 bp且作用位置向PAM端延伸2个碱基或csgRNA长度为20 bp且作用位置向PAM端延伸4个碱基时,其降低APOBEC-3B对Cas9-D10A/sgRNA产生的突变效果较好。结论:CsgRNA策略成功降低了APOBEC-3B对Cas9-D10A/sgRNA系统进行基因编辑时产生的突变。  相似文献   
2.
目的:为了检测CRISPR/Cas9系统的潜在脱靶效应,分别利用野生型Cas9和切口酶Cas9?D10A构建了RNA甲基转移酶Nsun5基因敲除小鼠模型,并对两种策略得到的F0小鼠进行脱靶分析,以比较两种敲除策略的特异性。方法:针对Nsun5基因第3外显子,设计1对sgRNA,将野生型Cas9 mRNA和切口酶Cas9?D10A mRNA分别同这对sgRNA混合后注入小鼠一细胞期受精卵中,实现靶基因敲除,比较两种Cas9得到的F0代敲除小鼠的脱靶效应。结果:利用CRISPR/Cas9和Cas9?D10A成功建立Nsun5基因敲除小鼠模型,对两种Cas9得到的F0代突变小鼠进行潜在脱靶位点分析,均未检测到脱靶位点的存在。结论:两种策略都成功构建了不含脱靶位点的Nsun5基因敲除小鼠模型,为进一步研究Nsun5的生物学功能打下基础。  相似文献   
3.
目的:利用PiggyBac转座子系统,构建可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,并针对人核受体基因构建sgRNA文库,进行顺铂耐药性基因筛选。方法:构建PB?TRE?Cas9?NLS?IRES?hrGFP?Zeo载体,与PB?CAG?rtTA以及转座酶载体一同电转到HeLa细胞中,通过药筛和挑选单克隆得到稳定细胞系;构建核受体基因sgRNA病毒文库,并感染可诱导表达Cas9的HeLa细胞系,筛选对顺铂具有抵抗性的克隆,并进行目的基因的测序鉴定。结果:挑选出可诱导表达Cas9的8E单克隆细胞株,在5个基因位点上可以进行高效编辑;感染sgRNA文库之后,挑选顺铂耐药的克隆,并鉴定出大部分克隆含有VDR sgRNA,经测序发现这些克隆中的VDR基因发生突变。结论:利用PiggyBac转座子系统,构建了可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,利用这个细胞系可以在多位点进行高效基因编辑,并可用于高通量文库筛选顺铂耐药性基因。  相似文献   
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