小鼠胚胎干细胞与复合丝素膜的生物相容性研究

探索胚胎干细胞与丝素材料结合的可行性及生物相容性,建立一套在丝素膜上小鼠胚胎干细胞的体外培养体系.通过形态观察、MTT比色法、克隆形成率分析、碱性磷酸酶检测、免疫荧光染色、核型分析等方法,研究丝素膜对小鼠胚胎干细胞的黏附、生长情况、未分化状态的维持、胚胎干细胞特性、遗传、分化等方面的影响.结果显示,两者之间具有良好的生物相容性,丝素膜材料支持小鼠胚胎干细胞的体外无限扩增和未分化特征,并保持其正常核型.证实丝素材料可作为胚胎干细胞结合的良好生物材料.     

胚胎干细胞移植对博来霉素所致小鼠肺损伤的治疗作用

目的 观察胚胎干细胞移植对博来霉素所致小鼠肺组织损伤的治疗作用,并探讨其作用机制.方法 将60只C57BL/6J小鼠随机分为6组,每组10只,分别为:空白对照组、不移植对照组、移植1次组、移植2次组、移植3次组和移植4次组;除空白对照组外,其余5组均经小鼠气管将博来霉素注射至肺部,制作肺损伤模型,然后分别将S8胚胎干细胞诱导分化而来的上皮祖细胞经4个移植组小鼠尾静脉注入其体内1～4次,空白对照组和不移植对照组注射等体积的生理盐水.实验28 d后,观察各组小鼠的存活时间;肺组织病理学变化;检测肺组织羟脯氨酸含量及肺组织匀浆中转化生长因子β_1和γ干扰素含量;并用β-半乳糖苷酶原位染色方法检测肺组织中上皮祖细胞定植情况.结果 (1)各组小鼠死亡率分别为:空白对照组无死亡,不移植对照组60%,移植1次组50%、移植2次组40%、移植3次组40%和移植4次组20%.(2)肺组织羟脯氨酸含量和肺组织匀浆中TGF-β_1含量由高到低依次为不移植对照组、移植1次组、移植2次组、移植3次组、移植4次组和空白对照组;肺组织匀浆中IFN-γ含量则相反;组间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(3)各组肺组织纤维化程度由重到轻依次为不移植对照组、移植1次组、移植2次组、移植3次组、移植4次组和空白对照组;除不移植对照组和移植1次组之间比较,差异无统计学意义外,其余各组之间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(4)随着移植上皮祖细胞次数增加,其在肺内定植的时间也相应延长,各组之间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 多次移植经S8胚胎干细胞诱导分化而来的上皮祖细胞可减轻博来霉素致小鼠的肺损伤;其作用机制可能与上皮祖细胞对肺组织中转化生长因子β_1和γ-干扰素等细胞因子的影响有关.     

一种以小鼠精子为主导的综合性保种体系

目的 利用活体保种、精子冷冻技术及辅助生殖技术建立一套安全的综合性保种体系.方法 以单侧睾丸摘除方法获得ICR、BDF1、C57BL/6J和GFP四种小鼠的附睾精子进行冷冻保存实验,术后恢复的公鼠继续用于自然繁育.如果无法自然繁育,则将冻融精子用于体外受精(IVF).如果冻融精子仍无法受精获得后代,则需要借助卵胞质内单精子注射技术(ICSI)进行胚胎构建,胚胎移植,直至获得后代.结果 单侧睾摘除的BDF1、C57BL/6J的公鼠可以继续繁育;不育的ICR和GFP小鼠的冻融精子IVF后,只有ICR小鼠可以得到正常的胚胎和子鼠;而以C57BL/6J 为遗传背景的GFP小鼠,其冻融精子只有采用ICSI技术,才可以得到子代.结论 精子冻融小鼠的遗传背景是影响IVF成功与否的关键性因素,同时还建立了一种以小鼠精子为主导的综合性保种体系,既可以达到品系保存的目的,同时又可以最大限度地利用小鼠品系.     

血管内介入技术制作兔局灶性脑缺血模型

目的 建立一种微创、可控性强的兔局灶性脑缺血再灌注模型.方法 健康成年新西兰家兔66只,随机分为模型组(n=34)和假手术组(n=32),采用血管内介入技术将微导丝由股动脉送入栓塞右侧大脑中动脉,2h后拔除微导丝建立模型,而假手术组微导丝进入右侧大脑中动脉后即退出.临床神经功能检查家兔左侧肢体对疼痛刺激的反应、蹲立时的姿势和行走时的步态;分别于术后6h、12h和2 周处死模型组和假手术组各24只家兔,取脑组织并行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,观察梗死灶情况;术后2周处死剩余家兔,取脑组织并行苏木精-伊红(HE)染色,观察脑组织病理学变化.结果 在模型组,临床神经功能检查显示家兔出现不同程度的偏瘫症状,建模成功率为94.12％;TTC染色证实术后6h存在脑梗死灶,12h后脑梗死灶趋于稳定;术后2周脑组织HE染色显示右侧额顶叶脑组织缺血性改变.假手术组家兔末出现上述症状及病变.结论 采用血管内介入技术制作兔局灶性脑缺血再灌注模型,该方法微创、可控性强,模型稳定可靠,是用于研究局灶性脑缺血较为理想的动物模型.     

3～4岁猕猴生理指标的测定

目的 建立3～4岁猕猴生理指标基础数据.方法 对100只3～4岁猕猴(♂ 50只,♀50只)进行了较全面的血液学和心肺功能等生理指标的测定,包括血常规30项、血液生化22项、凝血功能2项以及血压、心电图、呼吸次数.结果 血常规中,雌性猕猴的平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)极显著低于雄性猕猴(P＜0.01);雌性猕猴极显著高于雄性的项目有血小板计数(PLT)、血小板压积(PCT)、嗜酸性粒细胞计数(EO#)、嗜碱性粒细胞计数(BASO#)、嗜酸性粒细胞百分比(EO％)与嗜碱性粒细胞百分比(BASO％)(P＜0.01);显著高的项目有白细胞计数(WBC)和淋巴细胞计数(LYMPH)(P＜0.05).血液生化指标中,雌性猕猴极显著低于雄性的项目为尿素氮(BUN)、总胆红素(TBIL)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)与无机磷(IP)(P＜0.01);显著低的项目为天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)和直接胆红素(DBIL)(P＜0.05);雌性猕猴显著高于雄性的项目为血糖(GLU),血钙(Ca)和甘油三酯(TG)(P＜0.05).血凝与血压、心电图的各参数中,雌、雄性别的猕猴之间无显著性差异.呼吸次数的监测结果显示雌性猕猴的呼吸次数较雄性猕猴极显著减少(P＜0.01).结论 建立了3～4岁实验用猕猴的生理指标的正常值,为猕猴实验和疾病诊断中相关生理指标的分析提供了基础参考值.     

哺乳动物体细胞克隆及在动物转基因中的应用

哺乳动物体细胞克隆及转基因技术,近些年发展迅速。尤其1997年‘多利’羊的诞生,对推动哺乳动物克隆及转基因技术的发展具有里程碑式的意义。本文介绍了哺乳动物体细胞克隆的方法,存在的问题和体细胞克隆的机理研究。对这些方法和研究理论进行了讨论,并探讨如何利用克隆技术进行转基因动物的制备。     

Pristane诱导小鼠系统性红班狼疮动物模型的研究

目的:建立pristane诱导的系统性红斑狼疮(SLE)小鼠模型,并对该小鼠模型的发病机制进行初步的探讨。方法:6-8周龄雌性BALB/c小鼠单次腹腔注射pristane0.5mL,对照组单次腹腔注射PBS0.5mL,注射前及注射后每2周行流式细胞术(FCM)检测外周血中IFN-α分泌细胞(CD11b+Ly6Chigh)的比例及细胞活化状态B220+Aβ1dhigh),ELISA检测血清中自身抗体(anti-dsDNA,anti-smRNP,anti-ribosomalP0)的含量。至6个月处死动物,FCM检测腹腔细胞中IFN-α分泌细胞(CD11b+Ly6Chigh)的比例和脾脏中细胞的活化(B220,Aβ1d),采用直接免疫荧光法标记小鼠肾脏免疫球蛋白复合物及H&E染色评估小鼠肾脏免疫复合物的沉积及损伤情况。结果:小鼠腹腔注射pristane第2个月开始血清总IgG升高,第3个月起出现自身抗体阳性,到个6月时达到最高,并维持高水平至被处死;Pristane处理6个月后,Pristane处理组小鼠出现关节炎症状,肾脏免疫复合物的大量沉积和明显肾脏损伤。Pristane注射2周起,小鼠外周血中IFN-α分泌细胞(CD11b+Ly6Chigh)的比例明显高于PBS注射组,小鼠腹腔细胞中IFN-α分泌细胞的比例也明显升高;同时外周血和脾细胞中B细胞表面MHCII分子Aβ1d的平均荧光强度(MFI)均高于对照组,表明pristane处理组小鼠中B细胞发生了显著活化。结论:BALB/c小鼠腹腔注射pristane可诱导构建小鼠SLE模型,其SLE的发病可能与IFN-α的持续分泌导致B细胞的异常活化有关。该模型的建立为进一步研究SLE的发病机制提供了良好的动物模型。     

对B型白血病病毒敏感的两种近交系小鼠血液生理和生化指标的比较

目的：通过对FvB—Cre＋／一和FVB—ROSA转基因小鼠的血液生理和血液生化指标的测定和比较,为白血病模型动物的选择提供基础数据。方法：选取两种品系各10雌10雄56日龄小鼠,分别测定心率、血压,并采血进行血液生理和生化分析。结果：FVB—Cre＋／-和FVB—ROSA两种转基因小鼠的白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（nb）等各项生理指标及丙氨酸转氨酶（ALT）、门冬酸转氨酶（AST）、白蛋白（ALB）、碱性磷酸酶（AKP）、尿素氮（BUN）、总胆固醇（CHOL）等各项生化指标之间的差异均有统计学意义。结论：FVB—Cre＋／-和FVB—ROSA转基因小鼠在血液生理、生化数据上具有特点,可作为模型动物为白血病的治疗和研究提供支持。     

兔胚胎干细胞的早期培养条件初步研究

目的探索小鼠胚胎内胚层细胞和鸡胚提取物（CEE）对兔胚胎干细胞早期培养的影响。方法用全新的方法对兔胚胎干细胞的建系条件进行探讨。将分离到的囊胚期内细胞团接种到丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎内胚层细胞饲养层和几种不同的培养液构成的培养体系中,观察内细胞团的贴壁和生长状况,并对由内细胞团生长出的具有胚胎干细胞形态的细胞集落进行传代。结果以灭活的小鼠胚胎内胚层细胞作为饲养层,以78％D-MEM／F-12＋20％Knockout SR＋2mmol／L L—Glutamine＋1％MEM NAA＋O．1mmol／L β-mercaptoethanol＋8ng／ml hrbFOF＋2％CEE做培养液,兔内细胞团可以很好的贴壁,生长成具有标准的胚胎干细胞（ESC）形态的细胞集落。结论小鼠内胚层细胞和CEE联合使用可以很好的支持原代兔胚胎干细胞（RESC）的生长,小鼠内胚层细胞和CEE中可能含有某些抑制RESC分化的因子。     

饲养层体系的建立与胚胎干细胞的培养

胚胎于细胞(ES细胞)是南早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分离、抑制分化培养获得的多潜能细胞。ES细胞的研究已在多种动物实验中获得了突破性进展。ES细胞在体外培养不仅要保持其增殖能力,而且要维持其未分化的状态。由于饲养层细胞能分泌白血病抑制因子(IAF)等抑制ES细胞分化的凶子,目前,ES细胞的培养主要是以饲养层来维持其干细胞特性。本实验探讨了胎鼠成纤维细胞(MEF)的分离培养、传代及其作为饲养层细胞的处理条件,建立快速稳定的MEF培养体系,并在此基础上探索了小鼠ES细胞的适宜培养、传代条件。