NF⁃κB p65调控IRF⁃8基因启动子活性及其启动子结合元件的初步鉴定

目的：探讨大鼠核因子?κB（nuclear factor?κB,NF?κB）p65亚基在细胞内过表达和其活性变化对干扰素调节因子?8（interferon regulatory factor?8,IRF?8）基因启动的影响,并初步筛查IRF?8启动子上可能的p65结合元件。方法：采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术扩增大鼠p65基因蛋白编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到空载pIRES2?EGFP质粒中,构建大鼠野生型（wild type,WT）p65过表达质粒（pIRES2?p65 WT）。在此基础上,将p65第535位丝氨酸（serine,S）突变为天冬氨酸（aspartic,D）或丙氨酸（alanine,A）,分别构建p65持续活化突变型质粒（pIRES2?p65 S535D）和p65显性负性突变型质粒（pIRES2?p65 S535A）。之后应用生物信息学软件预测IRF?8基因启动子区p65的结合元件,并据此构建IRF?8启动子全长（full?length,FL）和3个截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3?IRF?8?FL（-1 892 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?1（-1 360 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?2（-752 ~ +174 nt）和pGL3?IRF?8?3（-68 ~ +174 nt）。将上述质粒行不同组合共转染人胚肾293T（human embryonic kidney 293T,HEK?293T）细胞,Western blot和荧光素酶实验分别检查p65的表达和IRF?8的启动子活性,并分析IRF?8启动子区可能的p65结合元件。结果：菌液PCR及测序证实上述质粒构建成功。分别将pIRES2?p65 WT、pIRES2?p65 S535D、pIRES2?p65 S535A和pGL3?IRF?8?FL共转染HEK?293T,发现过表达pIRES2?p65 WT或pIRES2?p65 S535D均可明显增加IRF?8启动子活性,且以pIRES2?p65 S535D更为显著;而过表达pIRES2?p65 S535A后,IRF?8启动子活性无明显变化。将pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1~3和pIRES2?p65 S535D共转染HEK?293T后发现,pGL3?IRF?8?3的启动子活性显著低于pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1和pGL3?IRF?8?2,提示大鼠IRF?8启动子-752~68 nt区域可能存在p65结合元件。结论：在HEK?293T细胞内过表达野生型或持续活化突变型p65可显著促进IRF?8基因的启动,且p65与IRF?8启动子的结合元件可能位于-752~-68 nt部位。     

SP1基因在sublytic C5b⁃9促大鼠肾小球系膜细胞增殖中的作用

目的：检查特异性蛋白1（specificity protein 1,SP1）在Thy?1肾炎（Thy?1 nephritis,Thy?1N）大鼠肾组织中和亚溶解型C5b?9（sublytic C5b?9）刺激的大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells,GMCs）中的表达情况,并探讨SP1表达上调对sublytic C5b?9促大鼠GMCs增殖的作用。方法：复制大鼠Thy?1N模型,同时用sublytic C5b?9刺激体外培养的大鼠GMCs,分别用real?time PCR和Western blot检查Thy?1N大鼠肾组织（体内）和sublytic C5b?9刺激的大鼠GMCs（体外）中SP1基因的mRNA和蛋白表达水平及其表达时相。与此同时,构建SP1基因的表达质粒（pEGFP?N1/SP1?His）和发夹状小干扰RNA质粒（SP1 shRNA,shSP1）。将上述质粒分别转染大鼠GMCs（同时设对照质粒转染组）,再给予或不给予sublytic C5b?9刺激。用real?time PCR和Western blot检查SP1表达量,并行CCK?8实验检查GMCs的增殖情况。结果：在Thy?1N大鼠肾组织和sublytic C5b?9刺激的大鼠GMCs中,SP1 mRNA和蛋白表达水平均显著上调,且其体内外表达时相较为一致。体外过表达SP1可显著促进GMCs增殖,而沉默SP1可明显抑制sublytic C5b?9诱导的GMCs增殖反应。结论：Sublytic C5b?9刺激大鼠GMCs后能通过上调SP1表达促进GMCs增殖。     

大鼠MIP⁃1α基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其IRF⁃8结合元件的初步鉴定

目的：构建大鼠巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞(HEK-293T)中过表达干扰素调节因子-8(interferon regulatory factor-8,IRF-8)对MIP-1α基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-8结合元件。方法：采用PCR技术,扩增出大鼠MIP-1α基因启动子序列,将MIP-1α基因启动子插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建MIP-1α基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-MIP-1α-FL)。将上述pGL3-MIP-1α-FL和本课题组已构建的大鼠IRF-8过表达质粒(pIRES2-IRF-8)共转染HEK-293T细胞,检测细胞内荧光素酶活性,确定IRF-8对MIP-1α基因的启动作用。同时,应用生物信息学软件预测MIP-1α基因启动子上IRF-8的结合元件,并据此构建3个MIP-1α基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(pGL3-MIP-1α-1~3)。将上述MIP-1α基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和IRF-8过表达质粒共转染HEK-293T细胞,再测定荧光素酶活性,初步确定IRF-8的结合元件。结果：菌液PCR及核酸测序证实,上述pGL3-MIP-1α-FL(-1400 ~ +94nt)质粒构建成功。将pGL3-MIP-1α-FL和pIRES2-IRF-8共转染HEK-293T后发现,过表达IRF-8可显著增加MIP-1α基因启动子活性。应用生物信息学软件预测发现MIP-1α基因启动子上IRF-8的结合元件(-1157~ -1144nt、-740~ -734nt、-683~ -670nt、-365 ~ -359nt、-249 ~ -236nt),并据此构建3个MIP-1α基因启动子截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3-MIP-1α-1(-453 ~ +94nt)、pGL3-MIP-1α-2(-352 ~ +94nt)和pGL3-MIP-1α-3(-3 ~ +94nt)。将pGL3-MIP-1α-FL、pGL3-MIP-1α-1~3和pIRES2-IRF-8共转染HEK-293T后发现,pGL3-MIP-1α-3的启动活性显著低于pGL3-MIP-1α-FL、pGL3-MIP-1α-1和pGL3-MIP-1α-2。提示,IRF-8可能结合在大鼠MIP-1α基因启动子的-352 ~ -3nt区域的IRF-8结合元件(-249 ~ -236nt)上。结论：本实验成功构建了大鼠MIP-1α基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-8在MIP-1α基因启动子上的可能的结合元件,为后续研究奠定了基础。