靶向MSTN基因shRNA表达载体的构建与鉴定

目的 旨在构建靶向MSTN基因的短发夹RNA (shRNA) 真核表达载体,并鉴定其在小鼠体内的抑制效果。方法根据MSTN基因的mRNA序列(NM_010834.3)设计siRNA,并挑选出3条可能具有良好干扰效果的siRNA,设计合成shRNA,构建pSIREN-MSTN-shRNA表达载体。通过肌内注射法将载体递送至小鼠体内,利用实时荧光定量PCR和Western blot法检测干扰后小鼠肌肉组织中MSTN的mRNA表达量和蛋白质表达水平。结果 测序鉴定表明pSIREN-MSTN-shRNA表达载体构建成功,3个重组质粒均能够明显降低肌肉组织中MSTN的mRNA和蛋白质水平,其中pSIREN-M819表达载体干扰效果最好,与对照组比较,MSTN的mRNA表达量降低了71%,蛋白水平也明显降低。结论 成功构建了pSIREN-MSTN-shRNA表达载体,并在小鼠体内能够有效抑制MSTN基因的表达。     

N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的融合表达、纯化和酶活性

将菌株SS-ori的N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因(DCase)插入到pMAL-c2X载体中,构建表达产物为麦芽糖结合蛋白(MBP)与DCase融合的重组子。该重组子在E.coliBL21中的表达产物为融合蛋白MBP-DCase(76.4ka),光密度扫描表明,其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的19%。经Amy-lose亲和纯化和Superose12凝胶排阻层析后达到了电泳纯。根据pMAL-c2X的背景,用FactorXa剪切后,可得约41.7ka的MBP和34.7ka的DCase。酶活性检测表明当用N-氨甲酰-DL-缬氨酸做为底物,A600=10时,每升菌体每小时可产生D-缬氨酸0.78g。     

肿瘤基因靶向治疗载体的构建和鉴定

目的构建并鉴定人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因核心启动子调控的EGFP基因表达载体。方法从体外培养的HepG2细胞中提取全基因组DNA,以此为模板,克隆得到hTERT基因启动子核心区基因片段(hTERTp)。设计引物以质粒pEGFP-N1为模板利用PCR扩增得到EGFP基因片段,将两者通过搭桥PCR扩增得到hTERTp-EGFP片段,经SacⅠ、XbaⅠ双酶切定向插入到pGL3-Enhancer载体中,得到重组表达载体pGL3-hTERTp-EGFP。将该表达载体瞬时转染HELF细胞和HeLa细胞后观察EGFP蛋白表达情况。结果重组质粒经测序后确认插入序列正确无误,瞬时转染48h后在HeLa细胞中可以看到EGFP蛋白的大量表达,而在HELF细胞中未见表达。结论成功构建了可以通过hTERT核心启动子调控治疗基因在肿瘤细胞中特异表达的重组表达载体pGL3-hTERTp-EGFP。