RNA干扰技术抑制类风湿关节炎成纤维细胞COX-2合成

目的 体外合成针对人环氧化酶-2（hCOX-2）的小分子干扰RNA（siRNA）,并转染人人滑膜成纤维细胞,通过比较不同siRNA抑制COX-2 mRNA表达、COX-2蛋白合成以及下游产物PGE2水平,旨在确定特异性阻断人滑膜成纤维细胞COX-2的siRNA.方法 分离、培养和传代人类风湿关节炎（类风关）滑膜成纤维细胞.设计合成4条针对hCOX-2 mRNA siRNA（1#-4#siRNA）,1条随机序列siRNA.设立1#-4#siRNA和随机序列siRNA组（NC）及未转染对照组（CTL组）.应用Lipofect AMINE 2000将上述siRNA分别转染人滑膜成纤维细胞,4 h后各培养孔加入终浓度为100 nmol/L的佛波酯.转染36 h、48 h后,各组提取蛋白质和总RNA,应用RT-PCR检测hCOX-2 mRNA表达水平,通过Western Blot检测hCOX-2蛋白表达水平.采用ELISA方法检测各组上清液PGE2的水平.结果 转染36 h,PCR结果显示,CTL、NC、1#siRNA、2#RNA、3#RNA、4#siRNA、阳性对照HeLa细胞组hCOX-2 mRNA电泳条带密度值分别为1、0.72、0.3、0.25、0.4、0.04、2.1.Western Blot结果提示上述各组hCOX-2蛋白密度值分别为1、1.04、0.52、0.39、0.9、0和2.48.转染48 h后,各组hCOX-2蛋白条带密度值分别为0.05、0.52、0.51、0.9和0.15.转染24 h、48 h和72 h后,4#siRNA组培养上清液PGE2的水平较其他各组低.结论 4#siRNA能有效抑制人滑膜成纤维细胞COX-2 mRNA表达和COX-2蛋白的合成,且上清液中PGE2水平最低,证实4#siRNA能特异性阻断COX-2在滑膜成纤维细胞表达.     

非甾体消炎药上消化道不良反应的防治

非甾体消炎药(non-steroid anti-inflammatory drugs,NSAIDs)可不同程度地引起胃肠道不良反应,是临床引起消化性溃疡和上消化道出血的常见药物,特别是在一些高危人群。此外还可增加患者的心血管事件如心肌梗死和卒中的危险,这使NSAIDs的药物选择和不良反应防治成为重要的临床和经济问题。NSAIDs的使用应选择恰当和必须的患者,并尽可能选用最小的剂量和最短的时间,并尽量避免多种NSAIDs联用。长期用药应限于那些不能耐受其他类型的镇痛药、并且能经常随访的患者。对NSAIDs消化道不良反应发生高危人群的用药应参照指南并积极采取预防措施。     

肝硬化腹水并发肝肾综合征的医源性因素

目的 分析各种医源性因素在肝硬化腹水并发肝肾综合征患者中的不良影响,以便更好地加强医院管理及指导临床.方法 2005年8月至2010年10月在建湖县第三人民医院住院的142例慢性乙型肝炎肝硬化腹水患者,将其中26例同时并发肝肾综合征的患者设为研究组,其余116例未并发肝肾综合征的患者设为对照组.回顾性分析2组一般资料及...     

反义金属蛋白酶抑制因子-1对肝星形细胞的影响

目的　探讨体外构建的反义金属蛋白酶组织抑制因子 (TIMP 1)表达质粒在大鼠肝星形细胞 (HSC)中的表达情况及对HSC活化后Ⅰ、Ⅲ型胶原量的影响。方法　双酶灌注和梯度离心法分离正常大鼠HSC ,培养 7～ 10d后活化为肌成纤维样母细胞表型。应用巢式RT PCR和基因重组技术构建能在真核细胞中表达的反义TIMP 1质粒并测序鉴定。应用脂质体介导重组质粒和 pcDNA3空质粒转染HSC ,经含 40 0 μg/mlG418的DMEM培养液筛选 3～ 4周 ,另设立空白对照组。Northernblot和Westernblot检测筛选后的HSC中TIMP 1表达情况 ;用FITC标记的Ⅰ型胶原为底物测定培养上清液内间质胶原酶活性 ;应用Westernblot方法对HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原进行半定量分析。结果　外源重组质粒能较大程度地抑制活化HSC中TIMP 1的表达 ,而pcDNA3空质粒和空白对照组则无类似结果。TIMP 1/GAPDH比值分别为 0 .67,2 .41和 2 .97(mRNA水平 ,P <0 .0 5)。TIMP 1/ β actin比值分别为0 .3 1,0 .98和 1.3 2 (蛋白质水平 ,P <0 .0 5)。外源重组质粒转染显著提高了间质胶原酶活性 ,酶活性分别为 0 .3 0 49,0 .14 11和 0 .1196(P <0 .0 5)。HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原量明显减少。Ⅰ型胶原 / β actin比值分别为 0 .63 ,1.78和 1.92 (P <0 .0 5)。Ⅲ型胶原 / β actin比值分别     

RNA干扰技术及其在抑制肝炎病毒复制中的现状

乙型和丙型病毒性肝炎是世界上引起慢性肝病、肝硬化及其严重并发症的首要原因。可导致显著的致残率、致死率并消耗巨额医疗费用。而目前临床上用于治疗HBV及HCV的方法仍有较多不足之处，如用多聚乙烯二醇结合的干扰素β（PEG-IFN—β）及利巴韦林联合用药治疗HCV感染，对不同的HCV基因型获得的持续病毒降低率仅为30％～60％，而约有25％～40％的患者对抗HCV治疗无反应；还有许多患者因抗病毒治疗产生的一系列严重不良反应（如流感样症状，贫血等）而不得不中止治疗。     

大鼠间质胶原酶哺乳动物表达质粒的构建和体外转基因表达

目的构建大鼠间质胶原酶哺乳动物细胞表达质粒并进行体外转基因研究。方法采用ＰＣＲ及基因重组技术构建融台有Ｆｌａｇ多肽的大鼠间质胶原酶哺乳动物表达质粒,用脂质体介导该表达质粒体外转染培养的ＮＩＨ３Ｔ３细胞,通过ＲＴ－ＰＣＲ方法在转染细胞中检测间质胶原酶融合蛋白的ｍＲＮＡ表达,采用ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法在转染细胞的培养上清液中检测间质胶原酶融台蛋白的分泌,采用明胶酶谱法检测表达的间质胶原酶的明胶降解活性。结果构建的融合Ｆｌａｇ的大鼠间质胶原酶哺乳动物表达质粒经脂质体介导体外转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞后能够转录、表达并分泌间质胶原酶融合蛋白,并且,这一表达产物具有降解明胶的酶活性。结论我们成功构建了融合Ｆｌａｇ的大鼠间质胶原酶哺乳动物细胞表达质粒,体外转染研究证实该质粒能够在ＮＩＨ３Ｔ３细胞中表达活性问质胶原酶,为进一步运用该质粒进行体内转基因等研究奠定了基础。     

甘草甜素对肝硬化动物模型肝脏内NF—κB结合活性的抑制作用

目的 从分子水平探讨强力宁生物活性的发生机理。方法 大鼠随机分为正常对照组,模型对照组,强力宁组,后两组给予四氯化碳和乙醇造模处理以诱导肝损伤,强力宁组在造模处理同时予强力宁治疗。各组大鼠在ＣＣｌ４等处理后第９周处死,收集血清和肝脏标本,测定血清ＡＬＴ活性并进行组织学观察。部分肝组织提取细胞核蛋白进行凝胶迟滞实验以观察ＮＦ－κＢ活性。     

鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子1多态性与乙型肝炎肝硬化的关系

目的 研究一种高加索人群丙型肝炎肝硬化风险评分模型(cirrhosis risk score,CRS)相关基因的多态性与中国人群乙型肝炎肝硬化的关系,评估该模型在乙型肝炎肝硬化中的应用价值.方法 用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法检测相关的11个单核苷酸多态性位点,研究人群包括肝硬化组患者和对照组无肝硬化表现者,分析各位点与肝硬化的关系,比较肝硬化组和对照组CRS值的差异.用x2检验检测哈维平衡验证样本的群体代表性.两组计量资料的比较用t检验或Wilcoxon秩和检验.单个单核昔酸多态性基因型等分类数据与肝硬化发生的关系用Pearson x2检验,差异有统计学意义的单核苷酸多态性位点进一步用Logistic回归分析判断在显性模型、隐性模型和加性模型下基因型与肝硬化发生的关系,计算比值比及95%可信区间,比值比经性别和年龄校正.结果 鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子1基因的rs2679757位点与肝硬化的发生相关(x2=6.79,P＜0.05),与AA纯合子相比,携带危险等位基因G的GG+AG基因型显著增加肝硬化的发生风险,比值比为1.63,95%可信区间为1.13～2.35.位于Toll样受体4基因的rs4986791位点和鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子1基因的rs62522600位点在中国人群中无多态性基因型.其他研究位点与肝硬化的发生无相关性(P＞0.05).肝硬化组和对照组的CRS中位数分别为0.57和0.62,两组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子1多态性rs2679757与乙型肝炎肝硬化的发生相关.高加索人群CRS模型相关的两个多态性位点在中国人群中缺乏多态性,该CRS对评估有无乙型肝炎肝硬化的发生无明显价值,其他多态性位点仍需进一步临床验证.

Abstract：

Objective A cirrhosis risk score (CRS) comprised of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in seven genes that predicts the risk of cirrhosis in Caucasian hepatitis C has been reported. The present study was to evaluate the association of 11 separate but related SNPs and the CRS with cirrhosis risk in Chinese hepatitis B patients. Methods A total of 563 Chinese subjects with persistent HBV infection (349 with evident liver cirrhosis and 214 without cirrhosis clinically or pathologically) were studied. The candidate SNPs were detected with a matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) method. The allele frequency and genotype distribution of each polymorphism as well as the CRS value within the cirrhosis and non-cirrhosis subjects were compared. Results The rs2679757 polymorphism of the antizyme inhibitor 1 (AZIN 1) gene was associated with the risk of cirrhosis ( x 2 = 6.79,P = 0.03, odds ratio for GG+AG versus AA = 1.63, 95% confidence interval = 1.13-2.35). A gene variant (rs886277) in the transient receptor potential cation channel subfamily M, member 5 gene (TRPM5) was associated with liver cirrhosis, but did not reach statistical significance ( x 2 = 5.77, P = 0.06). Two SNPs (rs4986791, rs62522600) are not polymorphic in Chinese. Genotype frequencies of other SNPs were not different between the cirrhosis and non-cirrhosis groups. The overall CRS values were not different between the cirrhotic and non-cirrhotic groups (median value 0.57 versus 0.62, Z = -1.05, P = 0.29). Conclusions SNP rs2679757 in the AZIN1 gene is associated with the risk of HBV-related liver cirrhosis in Chinese. The CRS for Caucasian population has limited applicability for predicting liver cirrhosis in Chinese hepatitis B patients. SNPs associated with cirrhosis prognosis in hepattis B patients and liver diseases with other etiologies warrant further clinical validation.     

基因多态性与肝纤维化

无论病因如何,肝损伤后的自然发展史存在显著的个体差别.HBV感染患者也可出现自然转阴、持续无症状携带状态、慢性化或恶变的不同转归[1].患者的临床转归除可能受病毒载量,病毒基因型、生活方式和环境因素影响外,宿主的遗传背景和基因多态性可能也在机体对病毒感染后的免疫反应、肝损伤和纤维化发生、向终末期肝硬化和肝癌的发展和转归中起到重要作用[2].     

强力宁对大鼠肝硬化肝脏内肝细胞生长因子表达的影响

本研究旨在观察四氯化碳（ＣＣｌ４）联用乙醇诱导的肝硬化动物模型肝脏内肝细胞生长因子（ＨＧＦ）ｍＲＮＡ表达的变化情况以及强力宁药物（国产甘草甜素辅以胱氨酸及甘氨酸的复方针剂）预防对其表达产生的影响。１．材料：雄性ＳＤ大鼠（体重２５０ｇ左右）２１只，购于中国医学科学院实验动物中心；克隆有ＨＧＦｃＤＮＡ片段的质粒来自上海医科大学分子遗传教研室；地高辛检测和标记试剂盒以及尼龙膜购于宝灵曼公司上海东进分公司，强力宁针剂由浙江海宁制药厂惠赠。２方法：大鼠随机分为正常对照组（ｎ＝３）．模型对照组（ｎ＝９），药…