高脂饮食诱导肥胖小鼠模型中氧化应激、炎症递质对骨代谢的影响及其可能机制

目的：探讨高脂饮食诱导肥胖小鼠模型中氧化应激和炎症递质对骨代谢的影响及其可能机制。方法：选用5周龄C57BL/6雄性小鼠16只,随机平均分为正常饮食组、高脂饮食组,分别用正常饮食和高脂饮食喂养。于实验16周末,测各组动物体质量,处死后取内脏脂肪并测量内脏脂肪/体质量比值;用ELISA法测量血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP-5b）、血清骨钙素（OC）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）;分别用硫代巴比妥酸（TBA）法和羟胺法检测胫骨骨组织丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性;用骨密度仪检测右侧股骨骨密度（BMD）;分别用免疫组织化学技术和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测骨组织骨保护素（OPG）和核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）蛋白及mRNA的表达;HE染色光镜观察左侧股骨组织形态学改变。结果：与正常饮食组相比,高脂饮食组体质量、内脏脂肪/体质量比值、骨组织RANKL mRNA/OPG mRNA比值、血清TRACP-5b、IL-6和TNF-α水平、骨组织RANKL表达及骨组织MDA均明显升高,差异均具统计学意义（P＜0.05）;而血清OC水平、骨组织OPG表达、骨组织SOD及BMD均明显下降,差异均具统计学意义（P＜0.05）。在组织形态学上,发现高脂饮食组股骨干骺端骨小梁分布稀疏,骨小梁变细及断裂,伴骨髓腔中有大量脂肪浸润。各指标的相关分析结果显示：BMD与骨组织SOD呈正相关（r=0.627, P＜0.01）,与内脏脂肪/体质量比值（r=-0.858,P＜0.01）、骨组织MDA均呈负相关（r=-0.538,P＜0.01）;SOD与OPG mRNA呈显著正相关（r=0.637,P＜0.01）,与TNF-α（r=-0.673,P＜0.01）、IL-6（r=-0.874,P＜0.01）、RANKL mRNA（r=-0.760,P＜0.01）及RANKL/OPG比值（r=-0.768,P＜0.01）呈显著负相关;而MDA与TNF-α、IL-6、OPG mRNA、RANKL mRNA以及RANKL/OPG无显著相关性（P＞0.05）。结     

银杏叶提取物对1型糖尿病心肌病大鼠心肌Bcl-2、Bax和caspase-3表达的影响

目的 探讨银杏叶提取物（extract of Ginkgo biloba,EGB）对1型糖尿病心肌病大鼠心肌Bcl-2、Bax和caspase-3表达的影响.方法 将30只SD雄性大鼠随机分成3组：正常对照组（Con组,n=10）、糖尿病模型组（DM组,n=10）和银杏叶提取物治疗组（EGB组,n=10）.用链脲佐菌素（strepozotocin,STZ）进行腹腔注射,建立1型糖尿病动物模型后用银杏叶提取物注射液腹腔注射建立EGB组,其余两组给予相同体积的生理盐水.于12周末用超声心动图仪测定左心室舒张末期容积（LVIDV）、左心室收缩末期容积（LVISV）、左心室射血分数（LVEF）和每搏射血量（SV）;测定左心室重量指数、血糖和血胰岛素水平;用TUNEL法测定心肌细胞的凋亡指数（AI）;用RT-PCR和Western blot法分别检测其Bcl-2、Bax和caspase-3的表达.结果 与Con组相比,DM组大鼠LVIDV（P ＜0.01）、SV（P ＜0.01）、胰岛素含量（P＜0.01）和心肌组织Bcl-2（P ＜0.05）的表达都显著降低;而左心室重量指数和血糖浓度（P＜0.01）、心肌组织中Bax （P ＜0.05）、caspase-3（P＜0.05）的表达以及Bax/Bcl-2比例均明显升高.当EGB干预治疗后,与DM组相比,大鼠LVIDV（P＜0.05）、SV（P ＜0.05）、胰岛素含量（P＜0.05）和心肌组织Bcl-2（P ＜0.05）的表达均显著升高;而左心室重量指数（P＜0.05）、血糖浓度（P＜0.01）、心肌组织中Bax （P ＜0.05）、caspase-3（P＜0.05）的表达以及Bax/Bcl-2比例（P＜0.05）均明显降低.但是TUNEL染色显示各组大鼠的心肌细胞凋亡率（cardiomyocyte apoptosis index,CAI）没有明显的差异（P＞0.05）.结论 银杏叶提取物可以通过增加Bcl-2的表达,降低Bax、caspase-3表达及Bax/Bcl-2比例,减少心肌细胞的凋亡,从而提高了糖尿病心肌病的心肌功能.这也提示EGB通过调节心肌凋亡相关基因的表达,减少细胞的凋亡是其治疗糖尿病心肌病的重要机制之一.     

miRNA-195抑制剂对高糖培养血管内皮细胞生物学行为的影响及机制

目的：探讨高糖环境下miRNA-195 抑制剂对血管内皮细胞行为的影响及机制。方法：培养人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）ECV304,分别用高糖（HG）、miRNA-195模拟质粒（mimic）、miRNA-195抑制质粒（inhibitor）、Sirt1激动剂白藜芦醇（RES）处理细胞株,CCK-8试剂盒检测增殖活力,RT-PCR检测miRNA-195及Sirt1 mRNA水平,Western blot检测Sirt1、p-FoxO1、FoxO1、Caveolin-1、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达水平,划痕实验检测HUVECs的迁移能力,transwell小室实验检测细胞侵袭能力,Matrigel胶检测HUVECs的成管能力。结果：HG促进HUVECs的增殖、迁移、侵袭,增强成管能力（P ＜0.05）;而miRNA-195inhibitor则明显抑制HUVECs的增殖、迁移,降低成管能力（P ＜0.05）。结论：miRNA-195 inhibitor或许通过miRNA-195/Sirt1/FoxO1/Caveolin-1/VEGF通路影响HG环境下HUVECs的生物学功能。     

慢性间歇低氧对小鼠骨密度和骨代谢的影响

目的：探讨慢性间歇低氧（CIH）对骨密度（BMD）和骨代谢的影响。方法将16只12周龄C57BL/6雄性小鼠按随机数字表法分为慢性间歇低氧组（CIH组）和正常对照组（CON组）,每组8只。CON组小鼠在正常环境下饲养,CIH组小鼠在间歇低氧环境下饲养,低氧暴露时间为每日9：00-17：00,6d/周,共8周。于8周末取血,用ELISA法测定血清抗酒石酸酸性磷酸5b （TRACP-5b）、骨钙素（OC）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平;取右侧股骨检测其BMD;取左侧股骨观察骨组织形态学改变,并分别采用免疫组化和real- time qPCR法检测骨保护蛋白（OPG）和核因子-κβ受体活化因子配体（RANKL）和其mRNA表达。结果与CON组相比,CIH组小鼠BMD、血清OC水平及OPG/RANKL mRNA比值均明显下降（P＜0.05或0.01）,而血清TRACP-5b、IL-6和TNF-α水平、骨组织内RANKL和mRNA表达均明显升高（P＜0.05或0.01）;但骨组织内OPG和mR-NA表达差异均无统计学意义（均P＞0.05）;小鼠股骨干骺端骨小梁分布稀疏,变细及断裂。血清IL-6水平与BMD呈负相关（P＜0.05）,与骨组织RANKL mRNA呈正相关（P＜0.01）;血清TNF-α水平与BMD呈负相关（P＜0.01）,与骨组织RANKL mRNA呈正相关（P＜0.05）。结论 CIH能导致骨吸收增加、骨形成下降和BMD下降,与低氧以及CIH引起的IL-6、TNF-α水平升高导致RANKL升高有关。     

miR-195抑制剂降低1型糖尿病小鼠肝脏氧化应激损伤

目的探究miR-195对1型糖尿病C57BL/6小鼠肝脏的Sirt1及其下游氧化应激和线粒体凋亡相关蛋白表达的影响。方法将小鼠分为对照组(Control组)、糖尿病组(DM组)、miR-195抑制剂组(DM+antago组)。按常规法复制DM组模型,miR-195抑制剂(2.5 mg/kg)转染DM+antago组小鼠。DM组及对照组只注射scrambled shRNA(2.5 mg/kg)作为对照。每周观察记录小鼠的体质量和血糖的增减情况。取新鲜的肝脏组织,一部分处理后制片并HE染色进行组织病理学观察;另一部分用于测定肝脏组织中MDA含量及T-SOD活力,并通过RT-qPCR和Western blot检测3组小鼠肝组织中相关指标的mRNA及蛋白含量。结果1)与对照组相比,DM组肝脏组织的小叶都表现出结构紊乱,肝细胞明显水肿,胞质疏松;与糖尿病组相比,DM+antago组肝细胞水肿情况有所减轻。2)与对照组相比,DM组miR-195mRNA的表达,MDA含量及AcFoxo1/Foxo1蛋白表达均明显升高(P<0.05),而Sirt1、Foxo1 mRNA及蛋白表达,T-SOD活力均显著下降(P<0.05);与DM组相比,DM+antago组miR-195mRNA的表达,MDA含量及AcFoxo1/Foxo1蛋白表达明显下降(P<0.05),而Sirt1、Foxo1 mRNA及蛋白表达,T-SOD活力均明显升高(P<0.05)。结论miR-195在1型糖尿病大鼠肝脏氧化应激中表达增加,Sirt1可能是miR-195的作用靶点。     

miR-138在乙醇诱导的大鼠心肌细胞系H9C2氧化应激中表达增加

目的观察miR-138对乙醇诱导的大鼠心肌细胞系H9C2的Sirt1表达及其下游氧化应激和线粒体凋亡相关蛋白表达的影响。方法将心肌细胞分为对照组(control组)、乙醇组(E组)、miR-138抑制剂组(I组);分别用含不同浓度乙醇的细胞培养液培养;MTT法检测H9C2细胞的活力;选择细胞活力接近80%的200 mmol/L乙醇浓度为最佳干预浓度。用Lipo2000,将miR-138抑制剂转染I组H9C2心肌细胞,孵育12 h后,分别用羟胺法测定心肌细胞中总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力;硫代巴比妥酸(TBA)法测定心肌细胞丙二醛(MDA)含量;用RT-qPCR检测心肌细胞内miR-138与Sirt1 mRNA的表达;用Western blot测定心肌细胞内Sirt1、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表达。结果 1)乙醇可以抑制心肌细胞的活力。2)与对照组相比,乙醇组心肌细胞中miR-138 mRNA的表达及MDA的含量、Bax和caspase-3的蛋白表达均明显升高(P0.05),T-SOD的活力、Sirt1 mRNA的表达及Sirt1和Bcl-2蛋白的表达均明显降低(P0.05);与乙醇组相比,miR-138抑制剂组心肌细胞中miR-138 mRNA的表达及MDA的含量及Bax、caspase-3的蛋白表达均明显降低(P0.05),T-SOD的活力、Sirt1 mRNA的表达、Sirt1和Bcl-2蛋白的表达和均明显升高(P0.05)。结论 miR-138在乙醇诱导的大鼠H9C2心肌细胞氧化应激中表达增加。Sirt1可能是miR-138的作用靶点。     

Drp1和Mfn2在棕榈酸诱导大鼠肝细胞损伤中的作用机制及姜黄素衍生物L6H4的干预作用

目的：研究棕榈酸（PA）诱导肝细胞损伤的体外模拟非酒精性脂肪肝（NAFLD）模型中线粒体发动相关蛋白1（Drp1）和融合蛋白2（Mfn2）的作用机制以及姜黄素衍生物L6H4的保护作用。方法：①分别以不同浓度的PA、油酸（OA）和PA+姜黄素衍生物L6H4的混合培养基培养大鼠BRL-3A正常肝细胞24 h。用MTT法检测细胞活力,以筛选制作体外模拟NAFLD模型的最佳PA浓度及姜黄素衍生物L6H4的干预浓度。②将细胞分为4组：对照组（CON组）、油酸组（OA组）、棕榈酸组（PA组）及姜黄素衍生物L6H4干预组（L6H4组）,分别给予正常培养基、含有OA的培养基、含有PA的培养基及含有PA和姜黄素衍生物L6H4的混合培养基进行干预,24 h后收获细胞。分别用羟胺法测定总超氧化物歧化酶（T-SOD）含量、硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量、Real-time PCR及Western Blot法检测肝细胞Drp1、Mfn2、Bcl-2、Bax、Caspase-3、TNF-α mRNA及蛋白的表达。结果：①不同浓度PA对BRL-3A细胞的生长均具有一定的抑制作用,差异具有统计学意义（P＜0.05）,并呈明显剂量依赖关系,0.1 mmol/L是分界点,而0.05 mmol/L OA对细胞活力无明显影响。因此选择0.05 mmol/L PA作为最佳造模浓度以建立NAFLD体外模型。②当姜黄素衍生物L6H4干预浓度≤10 µmol/L时,细胞活力均高于75%,浓度＞20 µmol/L时,细胞活力降至50%以下,差异具有统计学意义（P＜0.05）。10 µmol/L时是分界点,因此选择5 µmol/L作为后续L6H4干预浓度。③与CON组相比,PA组细胞MDA含量、Drp1、Bax、Caspase-3、TNF-α的mRNA及蛋白的表达均显著增加,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;而T-SOD活力、Mfn2、Bcl-2的mRNA及蛋白表达则显著下降,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;与PA组相比,L6H4组的MDA含量、Drp1、Bax、Caspase-3、TNF-α的mRNA及蛋白的表达均显著降低,差异均具有统计学意义（P＜0.05）,T-SOD活力、Bcl-2 mRNA及蛋白的表达显著提高,差异均具有统计学意义（P＜0.05）,但Mfn2的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：姜黄素衍生物L6H4减轻PA诱导的大鼠BRL-3A正常肝细胞的损伤,其机制可能与其减少肝细胞脂质过氧化反应,抑制线粒体的分裂及其下游线粒体凋亡途径及炎症因子信号传导有关。这可能是姜黄素衍生物L6H4防治NAFLD的机制之一。