成人胰岛来源的Nestin阳性前体细胞的体外培养及其诱导分化

目的 探讨成人胰岛来源的Nestin阳性前体细胞的体外培养、扩增及诱导分化为具有分泌胰岛素功能的B细胞的条件。方法 首先通过胶原酶消化的方法从成人胰腺组织中分离纯化出胰岛，在含有bFGF及EGF的增殖培养基中大量扩增获得Nestin阳性前体细胞，最后在含有HGF、activin-A、exendin-4等生长因子的培养基中诱导该前体细胞。结果 来源于成人胰岛的Nestin阳性前体细胞在体外可以大量扩增并表达ABCG2，而胰岛素不表达。在分化培养基中能分化为对高糖刺激反应的胰岛B细胞，胰岛素呈现阳性。结论 来源于成人胰岛的Nestin阳性前体细胞能够为今后糖尿病的细胞移植治疗提供大量有功能的B细胞，能够解决目前胰岛移植中供体来源不足的问题。     

NOD 小鼠胰岛的分离及其在体内外的生物学特性

目的 建立分离纯化非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠胰岛的方法,并对其体内外生物学特性进行研究?方法 采用改良的胶原酶消化结合Ficoll 密度梯度离心方法,分离纯化NOD 小鼠胰岛?应用体外糖刺激实验检测分离纯化的胰岛功能,以及通过监测移植小鼠的血糖?体重变化及糖耐量实验对移植胰岛的体内生物学功能进行分析,并通过HE 染色和免疫荧光染色检测肾被膜下移植胰岛的存活情况?结果 胰岛产率为(116 ±12)个胰岛/胰腺,纯度>90%?体外糖刺激实验结果显示,NOD 小鼠胰岛的糖刺激胰岛素释放水平明显低于KM 小鼠胰岛?胰岛移植实验显示,移植胰岛能有效改善糖尿病小鼠的血糖?体重和糖耐量,但改善作用一般仅能维持2 周左右?HE 染色和免疫荧光染色结果显示,肾被膜下可见胰岛素阳性的胰岛细胞团,并且在残存的移植胰岛细胞团周围存在大量淋巴细胞浸润?结论 通过改良的小鼠胰岛分离方法可由NOD 小鼠分离得到大量较高纯度的胰岛,可用于今后探索如何阻断自身免疫损伤保护移植胰岛的研究?     

成人胰腺干细胞分离、培养及鉴定

目的：从成人胰腺组织中分离并鉴定胰腺干细胞。方法：利用含bFGF的有血清培养基分离、培养出具有高度增殖能力的细胞群，采用RT－PCR技术检测其Nestin mRNA及Insulin mRNA表达情况。同时诱导定向分化，观察其分化后的状态。结果：从成人胰腺组织中分离出的条索状细胞具有高度增殖能力，其Nestin mRNA表达阳性，而胰岛素Insulin mRNA表达阴性，分化后的细胞形成胰岛细胞团样结构。结论：本研究得到的细胞具有高度增殖能力和分化成胰岛细胞的潜能，是来源于胰腺的胰腺干细胞。     

干细胞脑内移植有效标记研究:绿色荧光蛋白质粒标记的应用价值

目的:观察绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)质粒转化小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESC)的效果,以及将转化的胚胎干细胞移植入正常大鼠纹状体后,GFP质粒作为细胞存活情况示踪剂的效果。方法:首先利用感受态大肠杆菌提取大量高纯度GFP质粒DNA,然后将GFP质粒与脂质体孵育形成的转化复合物和小鼠胚胎干细胞共同孵育,使GFP质粒转入胚胎干细胞;筛选表达GFP的胚胎干细胞。将筛选后表达GFP的ESC移植入活体大鼠纹状体内,移植21d后,观察表达绿色荧光蛋白的移植细胞的存活情况。结果:GFP质粒转化以后的ES细胞团和单细胞都表达亮绿色的GFP,细胞打散计数证实大约60%的细胞携带GFP,移植21d后,大鼠脑内可见大量表达GFP的移植细胞。结论:脂质体可以将GFP质粒转入鼠的胚胎干细胞,携带有GFP的ES移植后21d,GFP可以作为示踪剂观察移植细胞的存活状况。脂质体辅助的GFP质粒转化胚胎干细胞是移植示踪的较好方法。     

基于无创血糖的糖尿病评估

为了提高糖尿病前期的检出率，在糖耐量受损（IGT）常规诊断方法的基础上，增加糖化血红蛋白作为糖尿病筛查的因素，构建一个IGT检测模型。采集受试者的身高、体质量、腹围、血压、皮脂厚度、空腹血糖和糖化血红蛋白作为模型的特征输入，用K-近邻算法和神经网络对其分类，模型输出包括血糖值正常、IGT和糖尿病。结果显示增加糖化血红蛋白作为分类特征后，神经网络和K-近邻算法的分类准确率分别为88.89%和93.09%，明显高于传统方法的分类准确率（83.33%和78.38%）。本研究提出的IGT检测模型对糖尿病的临床诊断有重要意义。     

链脲佐菌素诱导的食蟹猴糖尿病模型中胰腺巢蛋白阳性细胞的变化

目的探讨链脲佐菌素（STZ）诱导的食蟹猴糖尿病模型中胰腺巢蛋白（nestin）阳性细胞分布及生物学特性的变化。方法1型糖尿病模型食蟹猴5只，长期血糖监测和静脉葡萄糖耐量实验评价该模型的可靠性及稳定性，细胞培养、免疫荧光染色对糖尿病猴和正常猴的胰腺组织进行分析。结果（1）nestin阳性细胞在正常猴胰腺组织中主要分布于胰腺导管，少量分布于胰岛周边；而在糖尿病猴则主要分布于残存的胰岛中。（2）糖尿病猴胰岛内的大部分nestin阳性细胞同时表达胰升血糖素。结论STZ在选择性地破坏胰岛β细胞的同时，可引起胰腺nestin阳性细胞的分布及表型的变化。     

胚胎干细胞“五步法”体外诱导成为神经细胞的实验观察

目的：采用“五步法”将鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)诱导成为神经元和胶质细胞。方法：首先将ES细胞接种到铺有明胶的培养瓶里，在无滋养层细胞的情况下生长3d，然后将细胞悬浮培养4d成为胚胎体(，胚胎体经过无血清培养基培养6d，富集nestin阳性细胞，在有丝分裂原bFGF作用下扩增6d，最后经过烟酰胺诱导分化6d，共计经过5个步骤。结果：诱导出多量表达Tuj-1的不成熟神经元(约占分化后细胞数量的80％～90％)和表达神经胶质纤维酸性蛋白的星形胶质细胞(5％～10％)，还有少量表达微管相关蛋白Ⅱ的成熟神经元(5％～10％)。结论：“五步法”诱导使胚胎干细胞在分化过程中处于不同的阶段，最终诱导出大量不成熟的神经元，少量星型胶质细胞和成熟神经元。为利用不同成熟度的分化细胞移植治疗神经系统疾病提供了充足的细胞来源。     

食蟹猴胚胎干细胞的培养及向神经细胞诱导分化

目的 建立食蟹猴胚胎干细胞系体外培养体系,并诱导其向神经细胞分化,为在体移植实验奠定基础。方法 用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层,长期培养食蟹猴胚胎干细胞。在无血清培养基中添加小鼠重组Noggin的方式诱导其向神经细胞分化,并对分化各阶段细胞进行免疫组化染色检测分化效果。结果 食蟹猴胚胎干细胞在滋养层上成克隆样生长,可以长期扩增超过20代并保持胚胎干细胞的特性。诱导向神经细胞分化约14d,即可形成呈玫瑰花环样的神经前体细胞结构,可见大量Nestin阳性细胞,及部分Tuj-1阳性细胞;分化约21d时,可见大量Nestin阳性细胞以及大量Tuj-1阳性细胞;分化超过35d,可见GFAP阳性细胞,而Tuj-1阳性细胞减少。结论 成功建立食蟹猴胚胎干细胞的培养体系,在此基础上诱导其分化可获得大量神经前体细胞,尤其是早期神经细胞。     

青少年食蟹猴糖尿病模型的肝脏病理生理学研究

目的通过对胰岛素用量不足条件下链脲佐菌素诱导的青少年食蟹猴1型糖尿病模型肝脏病理生理学的研究,探讨长期高血糖所致青少年食蟹猴肝损伤特点及机制。方法通过静脉注射68 mg/kg的链脲佐菌素,诱导4只3岁的食蟹猴成为1型糖尿病模型,然后经长期的血糖监测和静脉糖耐量实验来评价该模型的可靠性及稳定性,造模4年后,对模型猴进行血生化、PAS染色、苏丹III染色及普通病理和超微病理等指标的检测,另外选取4只健康与模型猴年龄匹配的猴作为正常对照组,同时进行相应的检测。结果与正常对照组比较,糖尿病猴血清学检测指标中总胆汁酸、尿素氮、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆碱酯酶、乳酸脱氢酶、总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇明显升高。组织化学染色结果显示,与正常猴比较,糖尿病猴中央静脉区肝实质细胞肿胀,肝细胞PAS染色(糖原染色)加深,苏丹Ⅲ染色(脂肪染色)阳性细胞增多;电镜结果显示糖尿病猴肝细胞内胞质糖原颗粒增多;线粒体电子密度显著增高,结构不清;窦周隙内含有大量脂滴的肝星状细胞明显增多。结论在长期胰岛素用量不足血糖控制不理想的条件下,青少年食蟹猴1型糖尿病模型肝脏特异性的病理改变是肝糖原贮积和含有大量脂滴的肝星状细胞增生,这些病理改变与非酒精性脂肪肝病的病变特点存在显著不同,但其机制目前尚不清楚。      

不同提取方法对小鼠海马AD相关蛋白电泳的影响

目的:探索不同提取方法对小鼠海马AD相关蛋白电泳结果的影响,为更准确地研究不同干预条件下AD小鼠模型中海马AD相关蛋白表达量的变化提供研究基础。方法:分别采用新鲜组织试剂盒提取法、新鲜组织超声波破碎法、速冻组织试剂盒提取法和速冻组织研磨法提取C57BL/6小鼠海马组织蛋白,然后利用SDSPAGE电泳技术进行蛋白分离,考马斯亮蓝染色观察不同提取方法中蛋白条带的分布和数量,并进一步通过Western Blot分析不同提取方法对脑组织特异性蛋白免疫印迹结果的影响。结果:四种提取方法均能有效提取脑组织蛋白,其中新鲜组织超声法提取的海马组织蛋白总量最高。考马斯亮蓝染色结果显示:新鲜组织超声法提取的海马组织蛋白条带最为清晰,条带数量最多,但Western Blot分析结果显示:p-Tau(S396)通过新鲜组织试剂盒提取法获得的蛋白条带丰度最高,而Neurofilament-L通过新鲜组织超声波破碎法和速冻组织试剂盒法所获得的蛋白条带丰度最高,其他AD相关蛋白采用速冻组织研磨法均可获得较高丰度的特异性蛋白条带。结论:不同蛋白提取方法对不同脑组织蛋白的提取效率存在明显差异,速冻组织研磨法可高效提取大部分小鼠海马AD相关蛋白。