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1.
比格犬一种新雌激素β受体可变剪切体的克隆及鉴定   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的对比格犬雌激素β受体的新剪切体进行克隆与鉴定。方法以比格犬垂体组织为模板,用RT-PCR方法从垂体组织中扩增雌激素β受体,电泳确定新剪切体的存在情况.并对其进行克隆和序列测定.结果利用设计的引物得到2条明显电泳条带,通过测序表明其中一种为新的可变剪切体,目前此可变剪切体尚未见报道。结论得到了雌激素β受体的一种新的可变剪切体,有助于研究雌激素β受体可变剪切体的功能及其在生殖调控过程中的作用。  相似文献   
2.
目的筛选用于比格犬ERβ基因RNA干扰实验的细胞和检测所用引物。方法根据比格犬ERβ氨基末端区域和DNA结合区设计三对引物,用阳性质粒筛选最佳引物应用于RNA干扰效果检测,并利用293T、Hela和vero细胞的cDNA验证该引物的特异性。对这三种细胞内人ERβ基因的存在情况也进行了检测。结果经过三次重复性实验之后,结果显示引物C36684扩增效率高,且没有非特异条带,该引物对293T、Hela和vero细胞cDNA扩增时同样没有非特异性条带,但293T细胞中存在人的ERβ基因。结论引物C36684用于检测RNA干扰效率,而Hela细胞则作为RNA干扰实验的细胞工具。  相似文献   
3.
目的构建最有效的慢病毒介导RNAi干扰序列,未来将应用于比格犬ERβ419的未知生物学功能的探索。方法模拟比格犬ERβ419靶细胞筛选针对目的基因mRNA设计的最佳干扰序列实验,通过qRT-PCR和Western Blot技术筛选最佳沉默表达载体序列。结果qRT-PCR结果显示,ERβ419-shRNA1(P0.01)和ERβ419-shRNA3(P0.01)的差异表达极显著,Western Blot结果与qRT-PCR结果一致,ERβ419-shRNA3的干扰效果最佳。结论 ERβ419-shRNA3最有效地抑制了目的基因的表达,未来将应用于探索比格犬ERβ419未知生物学功能对比格犬生殖系统影响的研究,并进而预防和治疗比格犬繁殖机能障碍性疾病。  相似文献   
4.
目的观察比格犬Myc标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位。方法以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长。Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术(Western blotting)和间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence,IF)鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况。结果成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中。Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质。结论前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的基因编码蛋白定位在细胞中发生变化。  相似文献   
5.
目的获得B病毒gC蛋白的特异性表位抗原。方法利用长片段基因合成的方法,合成B病毒C蛋白的特性抗原表位基因,将该基因连接到pMAL-5x载体,转化到BL21受体菌进行表达,并纯化表达产物。结果成功的获得了B病毒gC蛋白的特异性抗原蛋白,该蛋白以可溶的形式表达。结论利用原核表达系统,可以产生B病毒gC蛋白的可溶性抗原,可以作为B病毒的检测抗原。  相似文献   
6.
目的 研究比格犬雌激素受体β(Estrogen receptor β,ERβ)及其剪接异构体在生殖调控中的功能,构建比格犬ERβ的pMAL-p5x/ERβ 480 DE3 E.coli重组菌株,并进行纯化和鉴定.方法 Trizol法提取发情期比格犬下丘脑总RNA,RT-PCR获得cDNA,以NCBI网站公布的比格犬ERβ基因CDS序列设计特异性引物,扩增ERβ保守区基因编码序列(16-496 bp),连接原核表达载体pMAL-p5x,筛选、鉴定阳性克隆并测序.将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,再转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,表达产物经经麦芽糖亲和树脂(Amylom Resin)亲和层析分离纯化,并对纯化的融合蛋白进行鉴定.结果 构建了pMAL-p5x/ER(a)480重组质粒,在DE3大肠杆菌中诱导表达出MBP-ERβ融合蛋白,SDS-PAGE显示分子量约为60 000,与预期结果一致;优化了MBP-ERβ表达体系的表达条件:分别在0.2%葡萄糖,100 μg/ml Ampcillin,0.1mmol/L IPTG 37℃培养5h或在0.2%葡萄糖,50 μg/ml Ampcillin,0.2mmol/L IPTG 37℃培养3h,融合蛋白表达效果比较好.结论 构建了pMAL-p5x/ERβ480原核表达重组质粒,获得了比格犬MBP-ERβ融合蛋白,为犬种属特异性ERβ多克隆抗体的制备及功能分析奠定了基础.  相似文献   
7.
目的比较比格犬的子宫、卵巢在间情期与发情期的组织形态学的差异,为后期研究奠定基础。方法用化学发光法测定了23只经产比格母犬的血清性激素水平,选取经血清学鉴定处于发情期的比格犬2只,间情期的比格犬4只的卵巢和子宫标本,中性多聚甲醛固定,石蜡包埋,常规HE染色镜检,拍照。结果间情期犬子宫及其内膜较薄,间质纤维增生,黄体中以初级卵泡为主,可见1~2个次级卵泡,未见成熟卵泡,卵泡和黄体细胞间纤维较多、血管少。发情期犬子宫及其内膜增厚,内膜腺体腔较大,部分腺体呈分枝状弯曲,腺上皮肿大,胞浆淡染,少数可见核下空泡。卵巢中卵泡数量较多,有初级、次级和1~2个成熟卵泡。黄体细胞数量多,排列规则,境界清楚,间质纤维比较疏松,血管多,未见空泡变性。间情期和发情期犬卵巢中未见明显白体。结论间情期比格犬的性激素维持在一比较低的水平,在发情前期雌激素水平迅速增高,而在排卵后比格犬的孕酮水平较高。随发情周期的变化,卵巢和子宫在形态学上发生相应的变化。  相似文献   
8.
目的在比格犬下丘脑-垂体-性腺轴上筛查雌激素受体13的剪接异构体。方法针对ERβmRNACDS序列的八个外显子,两两外显子依次组合设计引物,运用PCR法,以比格犬下丘脑、垂体、卵巢、子宫组织cDNA为模板扩增相应序列,测序后在NCBI网站比对,确定是目的基因后,用DNAMAN软件比对分析及手工校对,获得ERβ的剪接异构体。结果获得到了比格犬ERβ的四个剪接异构体,分别是第4外显子完整缺失的ERβ剪接异构体(缺失300bp),部分第4与部分第5外显子组合缺失的两个组合型缺失的ERβ剪接异构体(各缺失334bp,265bp),以及第七外显子完整缺失的ERβ剪接异构体(缺失181bp)。第4外显子完整缺失的剪接异构体和第7外显子完整缺失的剪接异构体获得了全长编码序列,另两个剪接异构体为部分编码序列。结论研究获得了比格犬ERβ的四个剪接异构体,为后续研究其在比格犬生殖调控中的作用机制打下了基础。  相似文献   
9.
目的 分析比格犬下丘脑-垂体-性腺轴,雌二醇β受体剪切异构体的存在情况.方法 根据NCBI数据库上的比格犬雌二醇受体的基因序列,设计两对特异性引物,以比格犬的卵巢、子宫、下丘脑和垂体的总RNA为模板进行反转录,并利用两对特异性引物扩增比格犬雌二醇受体的基因,对其中的主要条带进行克隆测序.结果 获得了比格犬雌二醇受体的全长cDNA序列,对主要条带进行克隆测序的结果表明,该序列是一种比格犬雌二醇受体的剪切异构体.结论 比格犬雌二醇β受体剪切异构体与小鼠和人的组成有较大的不同,需要进一步系统研究.  相似文献   
10.
目的黑线仓鼠白化突变系是一种新的实验动物模型,本研究旨在组织水平上观察黑线仓鼠与白化突变系皮肤组织中黑色素细胞的分布与定位,以揭示黑线仓鼠白化突变系发生的细胞学机制。方法本实验选择黑线仓鼠和白化突变系各6只,取背部皮肤,制备石蜡切片,分别采用多巴染色、多巴-甲苯胺蓝复染,光镜观察、拍照。结果 Dopa染色显示,在黑线仓鼠与白化突变系皮肤组织中均有成熟黑色素细胞的分布,主要存在于毛囊毛乳头中,且黑线仓鼠黑色素阳性区要明显高于白化突变系。结论黑线仓鼠的酪氨酸酶活性要高于白化突变系。  相似文献   
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