一种新的显微图像半定量分析方法

随着数字图像技术在生物医学研究领域的广泛应用,实验教学及科研工作中常常涉及图像半定量分析工作,如组织切片观察、免疫组织化学测定及荧光图像分析等.尽管有多种图像分析软件,如Image-Pro Plus,Northern Eclipse,Scion Image等软件,但存在价格昂贵,相关教程少,使用不便等缺点,难以在生物医学领域广泛应用,而实验人员尤其是学生更倾向于使用界面友好、操作简便及教程丰富的图像软件,Adobe Photoshop是著名图像软件,普及率高,兼容性好,该软件从CS3版本开始新增了图像分析及DICOM文件识别功能,但目前关于其在生物医学领域应用的相关文献较少,同时也存在明显的不足之处.因此本研究就Photoshop在显微图像半定量分析中的应用进行探讨,文中所涉及到的名词和使用方法可参考相关教程[1].     

Prkdc和Il2rg双敲除免疫缺陷小鼠的构建和初步应用

目的：构建NOD背景免疫缺陷小鼠,作为新的人源肿瘤异种移植(patient?derived xenograft,PDX)模型。方法：利用 CRISPR/Cas9技术获得NOD背景Prkdc和Il2rg双基因敲除小鼠,通过正常繁育得到能够稳定遗传的纯合子后代(命名为NYG 小鼠),流式细胞术检测小鼠外周血免疫细胞比例,移植接种新鲜肿瘤组织,观察记录肿瘤生长状况及HE染色观察传代PDX 肿瘤形态学特点。结果：NYG小鼠外周血小鼠无成熟的T细胞、B细胞和NK细胞表达,对移植的患者肿瘤组织几乎没有排斥反应,组织病理学表型及免疫系统未见明显异常。结论：成功构建NYG小鼠免疫缺陷小鼠,为肿瘤学基础理论及应用研究提供了新的PDX动物模型。     

利用双引导RNA的CRISPR-Cas9技术构建Nudt3基因敲除小鼠及其验证研究

一项针对肥胖人群的全基因组关联分析（Genome-wide Association Study, GWAS）研究提示,NUDT3在肥胖的发生发展过程中有潜在的重要功能,但是缺乏基因敲除小鼠模型进行进一步的研究。目的：利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术构建Nudix水解酶家族成员核苷二磷酸连接的部分X基序3（Nudix (nucleotide diphosphate linked moiety X)-type motif 3, Nudt3）基因敲除C57BL/6小鼠模型。方法：根据CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术的原理,在Nudt3基因第二个外显子位置及第二个外显子与第三个外显子间的区域分别设计两个引导RNA(guide RNA, gRNA),结合早期胚胎显微注射技术构建生殖系基因编辑嵌合体小鼠,并从中筛选出合适的基因敲除小鼠。在此基础上,采用反转录PCR（RT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Western Blot）技术验证Nudt3基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果：我们以较高效率获得了F0代基因编辑小鼠,通过繁育获得了F1代杂合子小鼠和F2代纯合子小鼠。检测结果显示: F2代纯合子小鼠的若干代谢调控组织（如肝脏、下丘脑等）中均无Nudt3表达。结论：Nudt3基因敲除小鼠构建成功。该小鼠模型为下一步的代谢表型鉴定以及机理研究提供了理想的动物模型。 [关键词] CRISPR/Cas9, NUDT3, 小鼠模型,肥胖,基因敲除     

一种高效的成年小鼠同步诱导多细胞胚胎及受精卵的双排卵实验方案

目的：探讨二次超排方案对提高成年小鼠超排效果和胚胎发育潜能的可行性。方法：首先比较常规双排卵方案与自然排卵、随机超排实验方案所获总卵数的差异,然后在初步研究外源孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）对自然受孕一次胚胎发育影响的基础上,进一步对常规双排卵实验方案进行优化。结果：优化后的双排卵实验组单只鼠平均总卵数高达61.7枚,与自然排卵组、随机超排组和常规双排卵组差异显著,提升了成年小鼠的超排卵效果。结论：优化后的超数双排卵方案为同步大量获得小鼠多细胞胚胎及受精卵提供了一种新的、高效的技术方法。     

乳腺癌细胞抗原负载的自体树突状细胞体内诱导特异性T细胞应答

Objective To explore the potential of autologous dendritic cells (DCs) loaded with breast tumor cells antigen in inducing tumor-specific T cells response in vivo. Methods Fresh tumor samples from patients with breast cancer were collected and made into apoptotic heat shock tumor cells. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated. DCs were induced from monocytes with granulocytemacrophage colony-stimulating factor (rhGM-CSF) and interleukin-4 (rhIL-4) combination for 5 days. DCs were co-cultured with autologous apoptotic heat shock tumor cells for 48 h. Twenty-four patients with breast cancers received four vaccinations of auto-DCs at 1 st, 2nd, 4th, and 6th week with cell number from 4×106 to 6×106. Results The vaccinations were well tolerated, and most patients experienced improved quality of life after DC immunization. Cytokine levels including IL-2, IL-12, TNF-α and IFN-γ in sera were obviously increased after DC vaccination [(68. 5±12. 4), (118. 2±31. 5), (78. 3±11.5) and (92. 6±14. 9) ng/L respectively] as compared with those before vaccinations [(33. 8±7. 2), (48. 5±10. 9), (18. 7±5. 3 ) and (20. 5±6. 3) ng/L respectively]. Both antigen specific delayed type hypersensitivity (DTH) reaction and the frequency of antigen specific IFN-gamma+CD8+T lymphocytes were examined after 4 times of DC vaccinations. The DTH tests were positive in 7 out of 10 patients. The frequency of IFN-γ+CD8+T cells was enhanced in 4 out of 10 patients. One out of 24 patients experienced a progressive disease, while the others showed no progress during a follow-up period of 34 months. Conclusion Autologous DCs loaded with heat-shocked apoptotic breast cancer cells antigen elicit specific anti-tumor T cell immune responses companying with high levels of Thl type cytokine secretion. DCs vaccination after surgery may be a novel and effective combination tool for tumor treatment.     

恶性黑色素瘤术后自体DC疫苗辅助治疗的临床疗效

目的探讨恶性黑色素瘤(MM)根治术后自体树突状细胞(DC)疫苗辅助治疗的临床疗效。方法 42例Ⅱ、Ⅲ期肢体MM术后患者分为两组,30例患者接受白细胞介素2(IL-2)/干扰素-α2b(IFN-α2b)常规免疫治疗(常规组),12例患者常规治疗同时联合DC疫苗(疫苗组)。观察DC疫苗的临床安全性和对患者免疫功能的影响。结果与常规组比较,疫苗组治疗后外周血CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+比值、自然杀伤(NK)细胞比率明显升高(P<0.05),治疗中无严重不良反应发生。随访结果显示,DC疫苗治疗能够显著延长根治手术后MM患者的无复发生存期。结论联合DC疫苗的免疫治疗能够提高MM根治术后患者的免疫功能,降低其复发转移,可作为MM患者安全有效的辅助治疗手段。     

pCAG⁃3×flag⁃PP2A Cα转基因小鼠构建及高表达系的筛选

目的：构建过表达pCAG?3×flag?PP2A Cα转基因小鼠,筛选高表达稳定遗传系,建立PP2A Cα基因相关功能研究模型动物。方法：将Flag蛋白标签序列与鼠源PP2A Cα cDNA 转录本设计成融合基因,插入CAG启动子下游,构建过表达载体pCAG?3×flag?PP2A Cα。通过原核显微注射技术,将线性化pCAG?3×flag?PP2A Cα质粒注射入受精卵雄原核,构建pCAG?3×flag?PP2A Cα过表达模型小鼠,PCR筛选阳性过表达小鼠。提取阳性过表达小鼠组织总蛋白,在蛋白质水平分析转基因小鼠3×flag?PP2A Cα的表达。结果：PCR 鉴定及测序结果证实,pCAG?3×flag?PP2A Cα 转基因载体及过表达pCAG?3×flag?PP2A Cα 转基因小鼠模型构建成功。Western blot筛选转基因高表达系小鼠。结论：筛选得到pCAG?3×flag?PP2A Cα高表达稳定遗传系小鼠。     

乳腺癌细胞抗原负载的自体树突状细胞体内诱导特异性T细胞应答

目的 以乳腺癌细胞抗原体外负载自体树突状细胞(DCs)对24例乳腺癌患者进行自身免疫,探讨其体内诱导特异性T细胞免疫应答的能力.方法 新鲜癌组织制备成热休克凋亡细胞抗原负载外周单核细胞来源DC,分别在采血后第1、2、4、6周于患者腹股沟淋巴结富集区进行皮内注射,细胞剂量为4×10+～6×106/次.结果 DC免疫治疗后患者血清抗瘤免疫因子水平明显上升:白细胞介素(IL)-2治疗前为(33.8±7.2)ng/L,治疗后为(68.5±12.4)ng/L;IL-12治疗前为(48.5±10.9)ng/L,治疗后为(118.2±31.5)ng/L;肿瘤坏死因子(TNF)-α治疗前为(18.7±5.3)ng/L,治疗后为(78.3±11.5)ng/L;干扰素(IFN)-γ治疗前为(20.5±6.3)ng/L,治疗后为(92.6±14.9)ng/L,治疗前后比较差异有统计学意义(P<0.01);DTH试验阳性率为7/10;4/10例IFN-γ+CD8+T细胞频率较治疗前明显增加.随访发现:除1例患者在治疗后3个月内疾病进展(PD),其余患者病情稳定无复发与转移症状(SD).结论 以乳腺癌细胞为抗原负载自体DC免疫患者,能够有效提高患者非特异免疫水平,激发体内特异性T细胞免疫应答,是一种安全、副反应较小、有效的乳腺癌辅助治疗手段.     

两种前列腺癌多肽负载的树突状细胞治疗晚期前列腺癌的临床初步研究

目的：探讨前列腺癌多肽PSMA-P1及PSMA-P2负载患者自体的树突状细胞治疗晚期前列腺癌的临床近期疗效和毒副反应。方法：选择8例非激素依赖型且HLA-A2阳性的晚期前列腺癌患者，分离出外周血中单个核细胞（PBMC）．用重组人粒细胞噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF）和白细胞介素4（rhlL4）体外诱导树突状细胞（Dendritic cells．DC），培养至第5天经催熟24h后，以PSMP1多肽与PSMP2多肽片段（HLA-A2阳性）进行负载。将成熟DC经皮内注射．观察患营的临床疗效．指标有客观缓解率、临床收益率和毒副反应。结果：8例前列腺癌患者血液中Th1细胞因子水平（IL-2，IL-12。IFN-γ/TNF-α）明显升高（P〈0．05）；3例患者肿瘤标志物PSA降低,2例平稳．1例升高。1例患者胸腔积液消失。3例早期患暂随访10～13个月，其中2例目前病情稳定，1例死于其他并发症。主要毒副反应为乏力及注射部位处轻微疼痛。结论：前列腺癌术后行多肽负载的DC瘤苗治疗，可改善患者的生活质量和免疫功能，且不良反应少，可明显控制PSA升高，缓解病情，值得推广应用。