稳定表达EGFP-LC3蛋白SH-SY5Y细胞系的构建

目的:建立稳定表达微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)与绿色荧光蛋白(EGFP)形成的融合蛋白(EGFP-LC3)的人神经母细胞瘤株SH-SY5 Y细胞系,验证EGFP-LC3点状聚集物能够实时直观地反映自噬小体和自噬流.方法:以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)的cDNA为模板,克隆LC3,并连接EGFP绿色荧光蛋白.将EGFP-LC3连接入慢病毒载体GV348中,构建慢病毒表达载体EGFP-LC3-GV348.慢病毒转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5 Y细胞),使用3μg/mL嘌呤霉素筛选并处理细胞1月,筛选得到EGFP-LC3稳转系.诱导自噬后,用共聚焦显微镜观察LC3荧光斑点并定量分析.Western blot检测目的蛋白表达情况.结果:经酶切证实,EGFP-LC3-GV348慢病毒表达载体构建正确.在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内的绿色荧光EGFP代表的自噬小体,活体染料LysoTracker Red DND-99将溶酶体染成红色荧光,红色荧光与绿色荧光重叠代表自噬溶酶体.无血清诱导自噬后,自噬小体(绿色荧光斑点)明显增加,差异有统计学意义(P<0.001).Western Blot免疫印迹可见EGFP-LC3融合蛋白表达条带.结论:成功构建了稳定表达EGFP-LC3的SH-SY5 Y细胞系,EGFP-LC3荧光斑点可以直观实时反映自噬囊泡,为进一步探讨神经退行性疾病的自噬机制提供了实验基础.     

5-Aza-cdR通过DNA甲基化调节BDNF参与学习记忆的机制

目的:研究5-氮-2'脱氧胞苷(5-Aza-cdR)通过影响DNA甲基转移酶功能,调节BDNF表达并参与学习记忆的相关机制.方法:以70只6～8周18～22克雄性ICR小鼠为研究对象,随机分为三组:注射PBS为C组,25只;注射5-Aza-cdR为注射组,30只;注射K252a为K252a注射组,15只.通过Western blot、real-time PCR、免疫荧光技术,检测小鼠海马脑区DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)和脑源性神经营养因子(BDNF)在mRNA和蛋白水平的表达变化,通过水迷宫实验检测小鼠的学习记忆能力.结果:与C组比较,小鼠经过5-Aza-cdR处理24 h后,DNMT3B的蛋白水平和mRNA水平均有所下降(P<0.05),BDNF的蛋白和mRNA水平显著增加(P<0.05).与C组比较,5-Aza-cdR注射组的BDNF荧光强度显著增强(P<0.05),小鼠找到目标平台的潜伏期显著降低(P<0.05),目标象限百分比以及目标象限穿越次数均显著增加(P<0.05).结论:5-Aza-cdR下调DNMT3B表达后,通过上调小鼠海马中BDNF的表达,可提高小鼠的学习记忆能力.     

透明细胞肾细胞癌的表观遗传学研究进展

正肾脏肿瘤的发病率在人类泌尿系统肿瘤中排名第3,约占恶性肿瘤的3%,发病年龄主要在50~70岁,每年导致90 000多例患者死亡,且呈递增趋势~([1])。肾癌的具体发病机制不详,除遗传因素外,吸烟、肥胖、污染和辐射等也是重要因素。大多数透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)患者在早期无任何症状,20%~30%患者在     

蒙药额尔敦-乌日勒对心肌损伤的修复作用及机制探讨

目的:观察蒙药额尔敦-乌日勒对斑马鱼心脏损伤后再生作用及其可能作用机制，验证其治疗的有效性，为进一步研究蒙药额尔敦-乌日勒提供实验依据。方法:利用转基因鱼系Tg(vmhc:mCherry-NTR)经甲硝唑(MTZ)处理后建立心室损伤模型，把90只受精3 d(3 dpf, days post fertilization)的斑马鱼胚胎随机分为对照组(DMSO,n=30)和心肌消融组(MTZ,n=30)以及心室损伤后额尔敦-乌日勒治疗组(MTZ+EW,n=30),治疗组在MTZ处理后24 h(24 hpt, 24 hour post treatment)用蒙药额尔敦-乌日勒混悬液以25μg/mL治疗。3组在72 hpt检测细胞增殖，用共聚焦显微镜观察细胞增殖情况并定量分析，同时应用RT-qPCR分析一氧化氮合酶(NOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的表达量。结果:治疗组斑马鱼胚胎经过蒙药额尔敦-乌日勒治疗后，心肌损伤后的再生修复比例明显上升，且再生心肌细胞的增殖速度较对照组加快、炎症因子表达量明显...