新型乙肝疫苗CpG-BW006佐剂对鼠脾B细胞表型和功能的影响

乙型肝炎病毒(HBV)感染是慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌的重要原因,目前尚无治疗HBV感染的特效方法.乙肝疫苗是预防HBV感染最安全、最有效的手段.然而,接种乙肝疫苗后的免疫应答受多种因素的影响,约有10％的人群对该疫苗反应低下或无反应[1].CpG为近年来佐剂研究的热点.由于CpG-ODN具有同时提高细胞免疫和体液免疫的特点,在体内主要诱导Th1型免疫应答,因此被认为是一种有潜力的新型免疫佐剂[2].本研究用一种新设计合成的含有CpG基序的寡核苷酸( BW006)联合HBsAg对B细胞表型和功能的影响进行研究,目的是探讨CpG作为乙肝疫苗佐剂诱导机体免疫应答的机制,为新型预防和治疗性乙肝疫苗的研发提供依据.     

重组乙型肝炎疫苗和乙型肝炎表面抗原诱导细胞免疫应答

目的 探讨重组乙型肝炎(乙肝)疫苗和汉逊酵母菌表达的乙肝表面抗原(rHBsAg)诱导动物和人体细胞免疫应答的动态变化.方法 应用不同剂量rHBsAg免疫小鼠(BALB/c,H-2d),酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测小鼠脾单个核细胞(MNC)体外刺激诱生IFN-γ的水平;单剂rHBsAg免疫后不同时间检测MNC、CD8+T淋巴细胞产生IFN-γ水平;同时测定免疫后不同时间细胞毒T淋巴细胞反应(CTL)活性;检测免疫单剂和多剂乙肝疫苗后小鼠MNC分泌IFN-γ、IL-2、IL-5和抗-HBs抗体水平;对乙肝感染标志阴性的4名成年人按0、1、2个月程序接种乙肝疫苗,检测免疫后外周血单个核细胞(PBMC)、CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4水平以及抗体动态.结果 应用ELISPOT法,汉逊rHBsAg免疫小鼠7 d时,可检测到IFN-γ应答,14 d时达到高峰;CTL在免疫后7 d时可检出,峰值位于28 d.在1～8μg免疫剂量范围内,MNCs IFN-γ免疫应答与剂量呈显著正相关(阳转率:Υ=0.951,P=0.049＜0.05;SFC:Υ=0.996,P=0.000＜0.05),在1～4 μg免疫剂量范围内,CD8+T淋巴细胞的IFN-γ与剂量也呈显著正相关(Υ=0.999,P=0.025＜0.05);三剂乙肝疫苗免疫小鼠诱生细胞免疫和体液免疫应答水平均显著高于单剂(P值均＜0.05);成年人接种汉逊乙肝疫苗后不同个体间细胞免疫和体液免疫应答的模式不同,IL-2、IL-4应答与个体抗体滴度有关.结论 用ELISPOT法成功测定了汉逊HBsAg免疫小鼠后不同淋巴细胞的细胞免疫剂量效应和CTL时间动态变化,并分析了成年人的细胞免疫应答特点,为规范疫苗细胞免疫评价提供了基础.     

乙型肝炎疫苗细胞免疫应答检测用参考品的制备和初步应用研究

目的通过研究重组乙型肝炎表面抗原（HBsAg）免疫小鼠诱导细胞免疫应答的特点，制备一批细胞免疫应答检测用参考品，规范乙型肝炎疫苗细胞免疫实验条件和操作。方法背部皮下分别免疫小鼠（BALB／c，H-2^d）0．5、1、2、4和8鹏的HBsAg，于免后7d，检测小鼠脾单个核细胞（MNC）体外刺激诱生IFN-γ的水平。分别免疫小鼠2、4μgHBsAg，免后7d，检测MNC分泌IFN-γ水平。结果1μg组可检测小鼠IFN-μ阳转；免疫剂量与IFN-γ阳转率存在剂量效应关系（r=0．951，P=0．049），IFN-γSFC与免疫剂量也存在剂量效应关系（r=0．996，P=0．000）。2μgHBsAg组IFN-1阳转率在50％-75％之间；4μg组IFN-γ阳转率均为75％。结论制备一批乙肝疫苗细胞免疫参考品，用于规范疫苗诱导细胞免疫应答的方法检测。     

母亲乙型肝炎病毒表面抗原阴性婴儿接种重组乙型肝炎疫苗(酵母)后的抗体无应答分析

目的探讨母亲乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原(HBsAg)阴性婴儿,应用国产重组乙肝疫苗(酵母)常规接种后的乙肝病毒表面抗体(抗-HBs)应答状况及其特征。方法在河南省开封市筛选母亲HBsAg阴性的7～24月龄婴幼儿8 093例,按0、1、6个月程序接种5μg国产重组乙肝疫苗(酵母),用固相放射免疫法检测抗-HBs,对<10mIU/ml者的性别、城乡、不同月龄等特点进行分析。结果2 970例7～10月龄婴儿中,56例抗-HBs<10mIU/ml,无应答率为1.89%。其中1 911例城市婴儿中7例无应答(0.37%),1 059例农村婴儿中无应答者49例(4.63%),城乡婴儿抗-HBs无应答率的差异有非常显著的统计学意义(χ2=66.87,P<0.01),不同性别婴儿抗-HBs无应答率的差异无显著的统计学意义。城乡婴儿抗-HBs无应答率的差异与疫苗管理及接种质量综合评估呈显著负直线相关。婴儿11～24月龄间抗-HBs下降速度快,至22～24月龄时,已有15.53%抗-HBs阴转,较7～10月龄时增加8.22倍。结论母亲HBsAg阴性的婴儿常规接种5μg国产重组乙肝疫苗(酵母)后,抗-HBs无应答率为1.89%。城市低于农村。全程免疫后婴儿抗-HBs的下降速度快,提示应加大新生儿期疫苗的剂量,重组乙疫苗(酵母)可由5μg/剂提高到10μg/剂。     

流感疫苗血凝素含量测定替代方法在甲型H1N1流感疫苗研发中的应用

目的:甲型H1N1流感爆发,使血凝素(haemagglutinin,HA)含量测定成为疫苗研发的关键制约环节。本研究采用替代方法来检测疫苗原液中HA含量,以解决这一制约瓶颈。方法:采用经验证的改良SDS-PAGE方法,测定HA在总蛋白中比例,结合总蛋白含量,计算出疫苗原液中HA含量,用以配制疫苗。以WHO提供的国际参考品对成品疫苗进行复测。结果:各企业采用该方法,检测疫苗原液,各原液中总蛋白在267～770μg·mL-1间,HA比例在23.1%～62.8%间,HA含量在104～303μg·mL-1间。各企业根据HA含量配制成品疫苗用于临床试验,复测结果证明临床剂量准确。结论:在甲型H1N1流感疫苗研发中,可采用HA含量测定替代方法。     

中国甲型H1N1流感疫苗质量分析

目的 通过对甲型H1N1流感疫苗批签发中的检测数据进行分析和比较,了解我国甲型H1N1流感疫苗的总体质量状况.方法 按照各企业注册标准对甲型H1N1流感疫苗进行资料审查和全项检定,对关键项目检测结果进行分析和比较.结果 甲型H1N1流感疫苗批签发总体合格率为99.8%,有效成分血凝素含量在标示量的90%～103%范围内,甲醛、卵清蛋白和内毒素含量等安全性指标均符合规定.结论 我国甲型H1N1流感疫苗各项检测总体情况良好,能充分保证疫苗的安全性和有效性,中国食品药品检定研究院的独立检验和批签发对保证上市疫苗的质量发挥了重要作用.

Abstract：

Objective To analyze the laboratory testing data of 2009 pandemic influenza A (H1N1) vaccines during lot release procedure, thus to know the overall quality status of this vaccines.Methods National Institutes for Food and Drug Control(NIFDC) carried out the laboratory test according to the specifications of each manufacture, and the results was analyzed and compared between manufacturer and NIFDC. Results 99.8% of vaccines batches were released by NIFDC, haemagglutinin contents were between 90% to 103 % of labeled values, and testing results slightly differ between manufactures and NIFDC,other items related to safety were all meet specifications. Conclusion The quality of H1N1 vaccines in China were satisfying, the lot release and independent test by NIFDC play important roles to ensure the vaccines' quality.     

不同种类乙型肝炎重组疫苗诱导免疫应答特点比较

目的 比较三种乙型肝炎重组疫苗(rHB)[乙型肝炎汉逊酵母重组疫苗(rHP)、酿酒酵母重组疫苗(rSC)和CHO重组疫苗(rCHO)]诱导小鼠细胞和体液免疫应答特点.方法 给3组小鼠(BALB/c,H-2d)分别皮下接种3种r}HB 3μg,于免疫后第4、7、10、14、25和35 d分离脾单个核细胞(MNC),应用酶联斑点法(ELISPOT)测定MNCs体外刺激后所产生的细胞因子IFN-γ、IL-2斑点形成细胞数(SFC).刺激物为多肽或HBsAg.同时测定免疫后不同时间的细胞毒T淋巴细胞反应(CTL)活性和小鼠血清抗-HBs水平.结果 应用ELISPOT法,不同种类rHB免疫小鼠后诱导分泌IFN-γ和IL-2峰值均为10-14 d;rHP诱导CTL活性(P=0.000<0.05)和分泌IFN-γ水平(P<0.05)均显著高于rCHO和rSC,且rHP于免疫后第10天诱导CTL杀伤率最高(39.8%);rHP组诱导分泌IL-2水平均显著高于其他两种疫莆组(P<0.05),第7和14天时,rSC组诱导产生IL-2水平均显著高于rCHO组(第7天t=4.595,P=0.001<0.05;第14天t=5.721,P=0.000<0.05);免疫后第7天3种疫苗诱导细胞免疫应答强度依次为rHP最强,rSC其次,rCHO最弱;小鼠血清抗-HBs阳转率和抗体滴度随免疫时间而逐渐上升,第7天时rCHO组抗体显著高于rHP组(P=0.044<0.05),第14天时rCHO组抗体显著高于rHP组(P=0.009<0.05)和rSC组(P=0.012<0.05).结论 3种疫苗免疫小鼠的应答特点不同,酵母重组疫苗早期诱导细胞免疫应答优于rCHO;rCHO的优势是诱导产生抗-HBs早,且滴度较高.     

新型CpG佐剂——BW006协同乙型肝炎病毒表面抗原活化小鼠B、T淋巴细胞的作用

目的探讨新型CpG佐剂BW006协同乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)对小鼠B、T淋巴细胞活化的影响。方法以BW006和(或)HBsAg体外刺激小鼠脾单个核细胞,检测B细胞膜表面分子CD80、CD86和T细胞早期活化分子CD69的表达水平。小鼠免疫BW006和(或)HBsAg后24h取脾,无菌分离单个核细胞,检测CD80、CD86和CD69的表达水平。结果 40μgHBsAg+5μg BW006体外刺激24h时,B细胞CD80、CD86阳性率显著高于对照组(27.36%±1.77%vs 10.41%±0.72%;98.92%±0.09%vs 74.85%±5.13%,P均<0.01),T细胞CD69阳性率显著高于对照组(12.47%±3.31%vs 7.15%±1.37%,P<0.01)。4μg HBsAg+20μg BW006联合免疫后,小鼠脾B细胞CD80的阳性率显著高于BW006免疫组(12.26%±2.33%vs 9.80%±1.17%P<0.05)和生理盐水免疫组(12.26%±2.33%vs 8.50%±1.34%,P<0.05),CD86阳性率显著高于生理盐水免疫组(63.84%±1.48%vs 56.69%±1.33%,P<0.05),T细胞CD69表达阳性率显著高于BW006组(33.97%±2.17%vs 31.32%±2.78%,P<0.05)和生理盐水组(33.97%±2.17%vs 27.77%±2.51%,P<0.05)。结论 BW006佐剂能有效辅助HBsAg活化B和T细胞,上调B细胞表面协同刺激分子CD80、CD86及T细胞早期活化分子CD69的表达。     

中国药典、欧洲药典和WHO草案甲、乙型肝炎疫苗质量控制标准与方法的比较

分析2010年版中国药典甲、乙肝疫苗标准部分修订及新增内容,并与欧洲药典6.0版甲、乙肝疫苗标准(以下简称欧洲药典)和WHO 2010年生物制品标准化专家会议确保重组乙肝疫苗质量、安全性、效力的建议草案(以下简称WHO草案)比较,2010年版中国药典甲、乙肝疫苗部分在生产工艺、质量标准、产品稳定性等方面的标准要求较2005年版中国药典有较大的提高,对于残留有害物质的控制进一步加强;欧洲药典和WHO草案对疫苗原液的比活提出了明确要求,对乙肝疫苗要求进行糖、脂成分测定。在今后药典的标准提高方面,应加强疫苗产品的比活及糖、脂质等方面标准和方法的研究,制定相应标准,保证疫苗的质量。