重组腺病毒表达载体介导艾滋病毒Vif蛋白调控KSHV潜伏感染的初探

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统包装含人类免疫缺陷病毒1型(艾滋病毒:HIV-1)病毒体感染性因子(Vif)的重组腺病毒,使之感染原发性渗出性淋巴瘤细胞系BCBL-1细胞,并检测Vif蛋白对细胞中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi'ssarcomaassociated herpesvirus,KSHV)潜伏感染与...     

卡波氏肉瘤病毒K1蛋白在血管内皮细胞中的表达及其功能初探

目的:获得稳定表达卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)K1蛋白的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),探究K1蛋白对HUVECs增殖和迁移能力的影响?方法:从本实验室已构建好的含KSHV K1基因的重组真核表达质粒pCI-neo-K1中扩增出K1基因,克隆入慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green中构建重组质粒pHAGE-K1?利用脂质体将pHAGE-K1与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,收集培养上清经0.45 μm滤膜过滤即获得慢病毒悬液?病毒感染HUVECs,Western blot检测K1蛋白的表达?通过绿色荧光蛋白进行流式分选?Western blot验证获得稳定表达K1蛋白的HUVECs?通过细胞增殖实验和细胞划痕实验检测K1蛋白对HUVECs增殖和迁移能力的影响?结果:核酸序列测定证实,克隆的K1基因全长906 bp,与GenBank中登记的K1基因100%同源?Western blot结果显示,含K1基因的重组慢病毒感染的HUVECs在约46 000处可观察到一特异性条带,与预期的K1蛋白大小一致?流式分选获得稳定表达K1蛋白的HUVECs,其增殖能力与对照组相比显著增强(P < 0.01),细胞迁移能力亦明显增加(P < 0.05)?结论:成功包装了含KSHV K1基因的重组慢病毒?KSHV K1蛋白能够促进HUVECs增殖和迁移?     

卡波济肉瘤相关疱疹病毒编码IL-6基因的分离克隆及在NIH3T3细胞中的表达研究

目的:分离克隆卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码IL-6基因(vIL-6),并导入NIH3T3细胞中进行真核表达。方法:根据KSHV编码IL-6基因核苷酸序列设计一对引物,在引物的5′端分别引入BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增vIL-6基因,PCR产物经双酶切克隆进真核载体pcDNA3.1( )。进一步在原有的下游引物5′端加上一段flag序列,以经过序列测定正确的重组质粒为模板,PCR扩增vIL-6-flag融合基因,构建含vIL-6-flag的重组质粒。将该质粒转染NIH3T3细胞,经G418筛选获细胞抗性克隆。最后用抗flagM2单克隆抗体进行Westernblot检测vIL-6在NIH3T3细胞中的表达。结果:获得vIL-6-flag融合基因,全长671bp,其中vIL-6基因核苷酸序列与GenBank中所登记的KSHVvIL-6基因呈现100%同源性。Westernblot结果显示,在约25ku位置有目的条带,与预期的重组vIL-6-flag融合蛋白大小一致。结论:KSHVvIL-6编码基因在NIH3T3细胞中初步获得表达。     

HIV-1 Rev基因编码蛋白在PEL细胞系中的表达及其表达蛋白抑制HHV-8溶解性周期复制

目的:构建含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒颗粒蛋白表达调节因子(regulator of virion protein expression, Rev)编码基因的重组真核表达质粒并初步探索Rev基因编码蛋白对人类疱疹病毒8型(HHV-8)溶解性周期复制的影响.方法:构建pRev-Flag重组质粒并进行酶切鉴定和序列测定;将pRev-Flag重组质粒瞬时转染原发性渗出性淋巴瘤细胞系(PEL)BCBL-1细胞和小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3,采用RT-PCR、Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Rev基因的表达情况;提取瞬时转染pRev-Flag重组质粒的BCBL-1细胞总RNA,进行RT-PCR检测HHV-8次要衣壳蛋白编码基因ORF26 mRNA转录水平.结果:核酸序列分析结果表明,克隆的Rev基因序列与GenBank中已登记的Rev序列100%同源.RT-PCR和Western blot都在Rev预期位置检测到特异性条带.RT-PCR检测显示,Rev基因对编码蛋白能够降低HHV-8 ORF26 mRNA转录水平.结论:成功构建含Rev基因序列的重组质粒并在真核细胞中获得正确表达;初步探索表明Rev蛋白能够抑制HHV-8溶解性周期复制.     

人类疱疹病毒8型包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备人类疱疹病毒8型（HHV-8）包膜糖蛋白K8．1的单克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：用异丙基硫代一β—D一半乳糖苷（IPTG）诱导含重组质粒pGEX-6p-1 ＋K8．1的大肠杆菌BL21表达符胱甘肽-S-转移酶GST／K8．1融合蛋白，将以包涵体形式存在的融合蛋白进行变性、复性、复性后的Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化。以纯化的GST／K8．1融合蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠．常规杂交瘤技术制备单克隆抗体。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选分泌K8．1单抗的杂交瘤细胞株。免疫组化染色（IHC）和Western blot法鉴定单抗的特异性。结果：建立了一株稳定分泌抗K8．1单抗的杂交瘤细胞株．命名为3G10：IHC和Westerfl blot法显示．3G10株单抗能特异地识别HHV-8K8．1蛋白。结论：成功制备出抗HHV-8包膜糖蛋白K8．1的单克隆抗体。     

HIV-1相关炎性细胞因子诱导人血管内皮细胞中潜伏感染KSHV的溶解性周期复制

目的 研究HIV-1感染相关炎症细胞因子是否能够激活人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）中潜伏感染的卡波济肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）；探讨该激活作用是否由KSHV Rta基因所介导。方法采用体外模拟系统，研究了与HIV-1感染T细胞诱生的细胞因子相似的重组人细胞因子对HUVEC中潜伏感染的KSHV复制的影响。通过Northern blot和定量PCR检测ORF26（该基因编码的病毒次要衣壳蛋白仅在KSHV被激活时表达）mRNA表达来分析KSHV的激活。运用KSHV Rta基因启动子（KSHV复制时最先被激活的启动子）驱动的虫荧光素酶报告基因进一步证实并扩展研究结果。结果包括干扰素-γ（IFN-γ）、肝细胞生长因子，扩散因子（HGF／SF）及制瘤蛋白M（oncostafin M，OSM）在内的重组细胞因子不仅可诱导HUVEC中潜伏感染的KSHV发生溶解性周期复制，而且能增强Rta启动子活性。结论 HIV-1感染相关的炎性细胞因子是诱导HUVEC中KSHV溶解性周期复制的因素．而日_该过程至少有部分由KSHV的Rta启动子介导．     

卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体的鉴定

目的:对已制备并经初筛的卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体进行特异性鉴定。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA),经3次克隆选择,筛选出能稳定分泌针对K8.1蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株共9株。采用Westernblot法评价9株杂交瘤细胞培养上清识别原核表达重组K8.1蛋白和原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1中KSHVK8.1包膜糖蛋白的能力。结果:筛选了9株能够稳定分泌抗K8.1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;Westernblot法显示,9株单抗均能特异性识别原核表达K8.1/GST融合蛋白和BCBL-1中KSHVK8.1包膜糖蛋白。结论:成功制备了KSHV包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体。     

人类疱疹病毒8型病毒干扰素调节因子编码基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)编码的病毒干扰素调节因子(virusinterferonregulatoryfactor,vIRF)基因K9,并将其导入真核细胞中进行表达。方法:根据GenBank登记的K9基因核苷酸序列设计一对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增K9基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建重组真核表达质粒pK9。为了便于蛋白检测,再设计第二对引物,上游引物不变,在下游引物5′端引入了Flag序列。以质粒pK9为模板再次PCR,扩增K9-Flag基因,并把K9-Flag序列克隆入pcDNA3.1( )中,得到重组质粒pK9F。重组质粒经酶切鉴定,核酸序列测定和分析后瞬时转染NIH3T3细胞,用RT-PCR、Westernblot分别从核酸和蛋白水平检测K9基因的表达情况。结果:PCR分离、克隆的K9-Flag序列全长1380bp,核酸序列分析显示克隆的K9基因与GenBank中己经登记的K9基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Westernblot都在K9预期位置检测到特异性条带。结论:HHV-8K9基因在NIH3T3细胞中获得了正确表达。     

HIV-1假病毒的构建及对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系的感染研究

目的:分离、克隆水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的包膜糖蛋白(VSV-GP)编码基因,包装人类免疫缺陷病毒1型human immunodeficiency virus-1,HIV-1)假病毒,并研究其对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系 BCBL-1 细胞的感染状况.方法:根据GenBank登记的VSV-GP基因核苷酸序列设计1对PCR引物,其5'端分别引入HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点.以质粒 pHCMV-G为模板,PCR扩增VSV-GP基因,经双酶切后定向克隆进真核表达载体 PcDNA3.1( )中,构建重组真核表达质粒 pVSV-GP.重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后与含包装和复制功能缺陷的 HIV-1 基因组重组质粒 pNL4-3.Luc.R-E-共转染人胚肾HEK 293T细胞.收获细胞进行Western blot,检测HIV-1 p24蛋白的表达;收获HIV-1假病毒感染 BCBL-1 细胞,进行虫荧光素酶(Luciferase)报告基因活性检测以及用ELISA的方法检测感染后细胞上清中 HIV-1 p24蛋白的含量.结果:PCR分离、克隆的 VSV-GP 序列全长1 536 bp,序列经过核酸分析证实;Western blot在 HIV-1 p24 蛋白预期位置检测到特异性条带;HIV-1 假病毒感染 BCBL-1 细胞后上清可以检测到HIV-1 p24蛋白,并且测得 Luciferase 活性值较对照组显著增高(P<0.05).结论:成功包装了 HIV-1 假病毒,并且该病毒可以感染 BCBL-1细胞.     

抗卡波济肉瘤相关疱疹病毒vIL-6蛋白合成肽多克隆抗体的制备及初步应用

目的制备与鉴定抗卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)病毒白细胞介素6(viral interleukin-6,v IL-6)多克隆抗体,并探讨将其初步应用于检测天然v IL-6蛋白的价值。方法设计并合成3条v IL-6候选肽,免疫新西兰兔,制备抗v IL-6多克隆抗体,用间接ELISA法鉴定该抗体的效价。构建重组质粒p HAGE-v IL-6并转染293T细胞和EA.hy926细胞,表达并纯化v IL-6-His融合蛋白,通过western blot鉴定抗v IL-6多克隆抗体对该蛋白质的识别。通过western blot和免疫荧光方法检测对KSHV阳性细胞中天然v IL-6蛋白的识别。结果由3号v IL-6候选合成肽制备的抗v IL-6多克隆抗体效价大于8 000,能特异性识别重组质粒p HAGE-v IL-6转染293T细胞和EA.hy926细胞产生的v IL-6-His融合蛋白,以及天然v IL-6蛋白。结论本实验采用合成肽作为半抗原制备的抗v IL-6多克隆抗体,可以应用于检测重组和天然v IL-6蛋白。