川党参的基因组DNA提取与ISSR引物筛选

目的 筛选最适党参基因组DNA的提取方法及ISSR (inter-simple sequence repeat)引物,为研究党参种植资源遗传多样性及DNA鉴定奠定基础.方法 以党参嫩叶作为材料,采用常规SDS法、改良CTAB法和试剂盒法3种提取方法基因组DNA,用优化的ISSR-PCR反应对100条引物进行筛选.结果 以党参嫩叶为材料提取基因组DNA,改良CTAB法效果最佳.从公布的100条ISSR引物中筛选出10条引物,能扩增条带清晰、稳定性好、多态性高的DNA条带.结论 以党参嫩叶为材料提取基因组DNA进行ISSR分子标志研究遗传多样性时应采用改良CTAB法,筛选出合适的引物在ISSR分子标志中很重要.     

DNA-PKcs影响肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的机制

目的利用RNA干扰技术探讨DNA-PKcs基因沉默影响肝癌细胞BEl7402/5-FU耐药性的机制。方法将靶向DNA-PKcs的干扰质粒shDNA-PKcs转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU,利用实时荧光定量PCR及Western blot法检测转染干扰质粒后DNA-PKcs基因的沉默效率;Western blot检测Artemis、磷酸化Artemis蛋白水平的表达。结果实时荧光定量PCR及Western blot检测结果显示转染shDNA-PKcs后,DNA-PKcs mRNA及蛋白水平表达均下调（P〈0.05）;Western blot检测结果显示shDNA-PKcs转染组Artemis蛋白表达水平与对照组相比均有所降低（P〈0.05）,磷酸化Artemis蛋白表达水平在转染前后无明显变化（P〉0.05）。结论 ShDNA-PKs干扰质粒能抑制Bel-7402/5FU细胞中DNAPKcs、Artemis蛋白的表达、但对P-Artemis的表达无影响。     

高效液相色谱法评价贵州金钱草代谢产物槲皮素和山奈素的多样性

目的： 建立金钱草中槲皮素和山奈素的HPLC测定方法,用以测定贵州省不同来源地的21份金钱草中槲皮素和山奈素的含量,并对其多样性进行分析。方法： 采用Alltima C₁₈柱（5 μm,250 mm×4.6 mm）,以甲醇-0.4%磷酸（50∶50,V/V）为流动相,柱温：25℃,流速：1.0 mL·min^-1,检测波长为360 nm;用SPSS 19.0软件对不同来源地金钱草中槲皮素和山奈素进行聚类分析。结果： 槲皮素和山奈素分别在0.028 6~0.196 5 mg （r=0.999 7）和0.047 7~0.381 4 mg （r=0.999 9）的定量范围内,色谱峰面积与进样量呈良好的线性关系,相关系数均大于0.999。槲皮素和山奈素在精密度实验、重复性实验和稳定性试验中的RSD分别为0.24%和0.58%、0.95%和1.32%、1.02%和1.08%,RSD均小于1.40％,加样平均回收率为99.42%和98.36%。不同来源地的21份金钱草中槲皮素和山奈素含量差异较大。结论： 用HPLC法测定金钱草中槲皮素和山奈素含量简单、精确、重复性高,贵州金钱草中槲皮素和山奈素含量差异较大,具有丰富的多样性及一定的地域性。     

shRNA沉默DNA-PKcs表达对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的影响

目的观察shDNA-PKcs沉默DNA-PKcs基因对肝癌耐药细胞Bel7402/5-FU耐药性的影响。方法采用双酶切、测序分析鉴定shDNA-PKcs干扰质粒;用阳离子脂质体法将shDNA-PKcs质粒转染BEL7402/5-FU细胞,根据荧光细胞数计算转染率,Real-time PCR及Western blot检测沉默效率;MTT法检测细胞药物敏感性;Real-time PCR和Western blot检测P-gp mRNA和蛋白表达。结果双酶切鉴定结果显示质粒约为6300bp,测序结果显示插入序列为shDNA-PKcs序列。荧光细胞计数显示质粒的转染率为62.2%。Real time PCR及Western blot检测结果显示DNA-PKcs mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为82.6%、71.8%;MTT检测结果显示shDNA-PKcs实验组的ADM和5-FU的IC50值比对照组ADM、5-FU低（P〈0.05）,DDP和MMC的IC50值与对照组比无统计学意义（P〉0.05）。Real time PCR和Western blot检测结果显示实验组P-gp mRNA、蛋白表达水平均比对照组低（P〈0.01）。结论 shDNA-PKcs干扰质粒能够有效抑制BEL7402/5-FU细胞中DNA-PKcs表达,增加细胞对化疗药物的敏感性,其机制可能与P-gp蛋白的下调有关。     

利用ISSR及代谢产物标记检测贵州金钱草遗传多样性

目的：结合ISSR分子标记与金钱草主要代谢产物标记对贵州省共21份野生金钱草资源的遗传多样性进行分析,为其驯化种植及遗传改良提供理论依据。方法：以金钱草基因组DNA为模板,以优化的PCR体系筛选出引物进行ISSR标记扩增,应用NTsys 2.10e软件,对所得数据进行分析处理,并采用高效液相色谱法测定了主要代谢产物槲皮素和山柰素的含量,使用SPSS 19.0软件对测定数据进行统计分析与绘制聚类图。结果：用筛选出的15条ISSR引物共扩增出105条多态性条带,多态性条带占比达98.1%,各金钱草种质资源之间的遗传相似性系数范围在0.598 1~0.953 3之间,地理位置相距越近,遗传相似性越高,不同资源的槲皮素和山柰素含量差异较大,ISSR标记的聚类将21份金钱草资源分为2大类群6个亚群,代谢产物标记的聚类将其分为2大类群5个亚群。结论：贵州野生金钱草具有丰富的遗传多样性,应用ISSR及代谢产物槲皮素和山柰素标记均能较好地对金钱草资源进行聚类,但聚类结果存在差异,其亲缘关系与地理位置呈现一定的关联性。