烟曲霉硫氧还蛋白还原酶双抗体夹心ELISA法的建立及初步应用

目的建立检测烟曲霉硫氧还蛋白还原酶Gli T(thioredoxin reductase Gli T,TR)的双抗体夹心ELISA法,并用于几种真菌培养上清液中TR蛋白的检测。方法纯化鼠抗人TR单克隆抗体并进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。以纯化羊抗TR多克隆抗体为包被抗体,HRP标记鼠抗人TR单克隆抗体为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法。用方阵滴定法确定包被抗体和检测抗体的最适浓度;对方法的精密度、特异性和最低检测限进行评价;比较分析其检测3种常见曲霉(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉)培养上清中天然TR蛋白的能力,并与3种常见假丝酵母菌(白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌)作比较。结果方阵滴定的结果显示最适包被抗体浓度为1μg/m L,最适检测抗体的稀释度为1∶3 000。抗原最低检测限达2.25ng/m L。重组TR浓度为5 ng/m L和20 ng/m L时,批内和批间变异系数分别为8.57%、12.69%和6.73%、10.45%。阻断实验显示该法有较好的特异性,阻断率达84.7%。该法可以检出烟曲霉24 h培养上清中的天然TR,TR含量与烟曲霉菌丝含量呈正相关。本法与另2种曲霉和3种假丝酵母菌培养上清无交叉反应。结论成功建立并优化了检测烟曲霉TR抗原的ELISA法。该法具有良好的精密度及特异性,对烟曲霉感染有潜在的诊断价值。     

假丝酵母菌属感染评分预测外科ICU患者侵袭性真菌感染

目的采用假丝酵母菌属评分(CS)以预测普通外科ICU患者侵袭性假丝酵母菌病(IC),弥补血培养方法的不足。方法采集2011年6月-2013年5月普通外科ICU 307例患者资料及微生物检验结果,结合临床诊疗实际,参考国外假丝酵母菌属感染评分标准(CS=2×脓毒症+1×外科手术+1×全肠外营养+1×假丝酵母菌属定植),以CS=3作为预测假丝酵母菌属感染的临界值,并将评分结果与真菌培养结果进行比较分析。结果 307例ICU患者中,CS≥3者145例占47.2%;确诊IC感染患者34例,感染率为11.1%;CS≥3的确诊感染IC患者33例,占总体确诊感染IC患者总数的97.1%。结论假丝酵母菌属评分方法早期预测ICU患者侵袭性假丝酵母菌病具有一定的价值,对临床预防性应用抗真菌药物有一定的指导意义。     

精子蛋白17抗体免疫磁性颗粒活性分析及细胞成像研究

目的:制备精子蛋白17(Sp17)抗体免疫磁性纳米颗粒, 以期用于卵巢癌的磁共振成像靶向诊断.方法:在偶联剂EDC/NHS作用下, 将壳聚糖修饰磁性氧化铁纳米颗粒与抗人Sp17抗体结合, 制备抗Sp17抗体免疫磁性纳米颗粒(IMNPs).透射电镜观察颗粒的形貌特征, 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳评价抗体与磁性颗粒的结合效果, ELISA检测免疫磁性颗粒的免疫活性.将IMNPs与转染人Sp17的卵巢癌HO-8910细胞共孵育, 进行体外磁共振成像检测.结果:成功实现了抗体与磁性纳米颗粒的偶联, 并且IMNPs保持良好的抗体活性.磁共振显示该颗粒成功靶向Sp17阳性的细胞, 没有发生明显的非特异吸附.结论:该免疫磁性纳米颗粒特异性良好, 可进一步用作卵巢癌的靶向治疗研究.     

血清抗烟曲霉二肽基肽酶Ⅴ肽段IgG类抗体ELISA法的建立及初步应用

目的建立检测人血清中抗烟曲霉二肽基肽酶Ⅴ(dipeptidyl peptidasesⅤ,DPPⅤ)肽段IgG类抗体(抗DPPⅤ)的ELISA法,评估其对侵袭性曲霉病(IA)的早期诊断价值。方法用重组烟曲霉DPPⅤ肽段作为包被抗原,建立检测血清中抗DPPⅤ的ELISA法,检测105例IA患者、200例非IA患者及200例健康人血清中抗DPPⅤ水平,确定cut off值,考查方法的精密度和特异性。部分IA患者抗DPPⅤ结果与抗烟曲霉硫氧还蛋白还原酶(TR)抗体(抗TR)检测和曲霉半乳甘露聚糖(GM)检测结果对比,评价其临床应用价值。结果以建立的ELISA法检测吸光度(A)值为6.688、0.709的2份抗DPPⅤ抗体阳性血清,批内变异系数(CV)为4.1%和8.0%,批间CV为7.1%和10.7%。重组抗原对血清中相应抗体的阻断率90%。以A值0.542为cut off值,对IA诊断的敏感性为66.7%,特异性为90.7%。非中性粒细胞缺乏的IA患者抗DPPⅤ阳性率(75.3%,55/73)高于中性粒细胞缺乏的IA患者(46.9%,15/32),差异有统计学意义(χ2=8.11,P0.05);92例IA患者血清抗DPPⅤ、抗TR和GM测定总阳性率分别为63.0%、60.9%和73.9%,差异无统计学意义(P0.05);中性粒细胞缺乏的IA患者GM阳性率(89.7%)显著高于抗DPPⅤ、抗TR的阳性率(41.4%和34.5%),χ2分别为14.96、18.75,P均0.01。抗DPPⅤ与抗TR联合检测阳性率达到82.6%,抗DPPⅤ、抗TR和GM试验三者联合检测的阳性率可提高到96.7%。结论检测抗DPPⅤ抗体的ELISA法精密度和特异性较好,对侵袭性曲霉感染具有潜在的辅助诊断价值,联合多个指标检测可提高诊断的敏感性。     

比较两种方法修饰的免疫磁性纳米探针在小鼠体内肿瘤磁共振成像中的作用

目的 评价两种免疫磁性纳米探针(Anti-Sp17-Silane@MNPs和Anti-Sp17-CS@MNPs)对小鼠体内肿瘤MRI的靶向效果.方法 分别将硅烷和壳聚糖修饰的磁性纳米粒与抗Sp17单克隆抗体交联,形成两种免疫磁性纳米探针(Anti-Sp17-Silane@MNPs和Anti-Sp17-CS@MNPs),对荷瘤裸鼠注射后进行MR扫描,并解剖实验鼠,取器官组织(肺、肝和肿瘤)进行普鲁士蓝染色,观察铁粒子聚集情况.结果 两种探针注射2 h后,肿瘤感兴趣区均可见T2信号明显降低,Anti-Sp17-CS@MNPs组降低更为显著.组织学检查见Anti-Sp17-Silane@MNPs注射组在肺、肝均有明显铁粒子聚集,而Anti-Sp17-CS@MNPs注射组各个器官组织铁粒子非特异聚集明显减少.结论 MRI中, 对于小鼠体内肿瘤,Anti-Sp17-CS@MNPs探针比Anti-Sp17-Silane@MNPs特异性更好.     

烟曲霉深部感染家兔模型的建立

目的 建立烟曲霉播散性感染家兔模型,为进一步研究烟曲霉深部感染的致病机制及诊疗措施提供可用的动物模型.方法 免疫抑制新西兰大白兔致其免疫功能低下,经耳缘静脉注射烟曲霉分生孢子致感染.通过观察各组家兔的生命体征及尸检、脏器培养、组织病理结果等鉴定感染结局.结果 实验组各家兔具有感染症状(体重渐减,体温≥39.5℃),解剖发现明显的组织病理学改变,脏器培养鉴定为烟曲霉,组化染色查到菌丝.结论 成功的建立了烟曲霉深部感染家兔模型,为烟曲霉感染过程中致病机制的研究及研制新型诊疗措施提供了依据.     

人穿孔素C端肽段的放射诱导表达

目的 观察克隆的人穿孔素(perforin,PFN)羧基端肽段在肺癌细胞SPC-A1中的放射诱导表达及其对该细胞的杀伤活性.方法 用PCR方法获取hPFN-C基因片段,将该基因片段克隆到含放射诱导启动子的真核表达载体pcDNA3.1( )/Egr-1,脂质体介导转染SPC-A1细胞.放射诱导表达后,RT-PCR、免疫细胞化学方法检测该基因片段在SPC-A1中的表达.MTT法检测该基因片段的表达产物对SPC-A1细胞的杀伤活性.结果 成功获取hPFN-C基因片段,构建了放射诱导表达的真核表达载体,转染SPC-A1细胞后,免疫细胞化学法证实目的蛋白出现在细胞质中,而未照射的细胞则没有hPFN-C基因表达. MTT法检测显示,与对照组相比,有hPFN-C 表达的SPC-A1细胞存活率仅为0.657.结论 成功构建hPFN-C基因片段的放射诱导表达载体,它在SPC-A1细胞中获得可控性表达,其表达产物对该细胞具有较强的杀伤活性.     

噬菌体模拟抗原替代亲环素A在测定自身抗体中的应用

目的 探讨噬菌体展示肽库来源的模拟抗原替代重组人亲环素A(rhCyPA)在测定自身免疫病人血清抗亲环素自身抗体中应用价值。方法 以抗人亲环素A单克隆抗体(McAb)D4和E6作捕获抗体对噬菌体展示肽库进行淘筛，通过序列测定推断出模拟抗原氨基酸序列。再以筛出的模拟抗原包被微孔板，与重组人亲环素A抗原进行对比，用ELJSA法检测系统性红斑狼疮患者血清抗亲环素自身抗体。结果 从12肽库淘筛出的10个噬菌体克隆中9个共有一致氨基酸序列HWEYTISPHPRL。56例SLE患者血清用12肽模拟抗原的ELISA测定，CyPA自身抗体阳性率为50％(28／56)，用rhCyPA作包被抗原测定阳性率为43％(214／56)；两法检测34例其他自身免疫病的阳性率均为11％，两法结果符合率为95．6％。通过试验比较，12肽模拟抗原用于检测CyPA自身抗体优于重组抗原和7肽模拟抗原。结论用抗CyPA单克隆抗体从噬菌体展示肽库淘筛出的特异12肽能模拟亲环素A抗原表位信息，可以代替亲环素A用来检测其自身抗体。     

白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶重组蛋白的制备及鉴定

摘要：目的：制备有免疫原性的白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶（fructosebisphosphate aldolase, Fba1)重组蛋白。 方法：以白念珠菌C1标准株基因组DNA为模板,用PCR法扩增Fba1 DNA序列,与克隆载体pMD18-T连接、测序,再与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组表达质粒pET28a(+)/Fba1,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组融合蛋白表达,亲和层析柱纯化重组蛋白。用抗His标签的单克隆抗体鉴定融合蛋白,并用确诊为侵袭性白念珠菌病（ICAI）、且抗白念珠菌烯醇化酶抗体阳性的患者血清进行抗原性鉴定。 结果：Fba1 DNA序列与GenBank中的序列一致。在大肠埃希菌中获得白念珠菌Fab1重组蛋白的高效表达,表达产物以可溶性蛋白为主,最终蛋白质得率为7.6 mg/g湿菌。经免疫印迹鉴定,重组蛋白与抗His标签的单克隆抗体和确诊ICAI患者血清呈特异性反应,显示出良好的抗原反应性。 结论：成功制备了具有良好抗原反应性的重组蛋白,为建立特异性诊断ICAI的新方法打下基础。