Prkdc和Il2rg双敲除免疫缺陷小鼠的构建和初步应用

目的：构建NOD背景免疫缺陷小鼠,作为新的人源肿瘤异种移植(patient?derived xenograft,PDX)模型。方法：利用 CRISPR/Cas9技术获得NOD背景Prkdc和Il2rg双基因敲除小鼠,通过正常繁育得到能够稳定遗传的纯合子后代(命名为NYG 小鼠),流式细胞术检测小鼠外周血免疫细胞比例,移植接种新鲜肿瘤组织,观察记录肿瘤生长状况及HE染色观察传代PDX 肿瘤形态学特点。结果：NYG小鼠外周血小鼠无成熟的T细胞、B细胞和NK细胞表达,对移植的患者肿瘤组织几乎没有排斥反应,组织病理学表型及免疫系统未见明显异常。结论：成功构建NYG小鼠免疫缺陷小鼠,为肿瘤学基础理论及应用研究提供了新的PDX动物模型。     

C57BL/6J小鼠冻融IVF原核胚用于Cas9显微注射探讨

目的探讨小鼠体外受精(IVF)冻融后用于Cas9注射的可行性。方法新鲜C57BL/6J小鼠卵子IVF后采用冻存管法(EFS20/40)冷冻原核胚(单细胞胚)和2细胞胚胎,次日复苏后培养。比较冻融原核胚和2细胞胚胎的回收率及成活率。选取部分冻融原核胚与新鲜原核胚同时进行Cas9和稀释液胞质注射并培养至2细胞,分别比较注射后的存活率及2细胞发育率。结果冻融后的B6小鼠原核胚的回收率为92.5%、成活率为92.8%,2细胞胚的回收率为90.5%、成活率95.8%,两组数据差异无显著性(P0.05)。新鲜原核胚Cas9注射后的存活率为92.7%,空白组注射组为97.5%,冻融原核胚Cas9注射后的存活率为82.6%,空白组为92%,冻融组Cas9注射与各组差异有显著性(P0.05),其它各组差异无显著性(P0.05)。注射后的2细胞胚发育率差异无显著性(P0.05)。结论冻融原核胚可用于Cas9显微注射。     

一种高效的成年小鼠同步诱导多细胞胚胎及受精卵的双排卵实验方案

目的：探讨二次超排方案对提高成年小鼠超排效果和胚胎发育潜能的可行性。方法：首先比较常规双排卵方案与自然排卵、随机超排实验方案所获总卵数的差异,然后在初步研究外源孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）对自然受孕一次胚胎发育影响的基础上,进一步对常规双排卵实验方案进行优化。结果：优化后的双排卵实验组单只鼠平均总卵数高达61.7枚,与自然排卵组、随机超排组和常规双排卵组差异显著,提升了成年小鼠的超排卵效果。结论：优化后的超数双排卵方案为同步大量获得小鼠多细胞胚胎及受精卵提供了一种新的、高效的技术方法。     

调整精卵交汇时间提高C57BL6J小鼠超数排卵的受精率

目的通过调整精卵交汇时间,提高C57BL/6J小鼠超数排卵的受精率。方法实验一以常规超排方法作为对照组,计算受精率;实验二验证C57BL/6J雄鼠受精能力;实验三在合笼后三个时间点检栓,确定超排鼠交配时间,计算精卵相遇时间;实验四将C57BL/6J雌鼠超排处理,停留6.5 h后配雄鼠,计算受精率,比较方法改进的效果。结果对照组取受精卵10.88枚/只;实验二取受精卵20.55枚/只,表明雄鼠的精子可以使卵子高比例受精,精子、卵子交汇时间是影响受精率的关键因素;实验三,在合笼后4 h雌鼠见栓鼠最多,确定对照组精卵交汇时间需7 h;根据以上实验结果,实验四将合笼时间推迟6.5 h,取受精卵22.27枚/只,比对照组提高了105%。结论调整精子、卵子交汇时间可显著提高C57BL/6J小鼠超数排卵受精率。     

pCAG⁃3×flag⁃PP2A Cα转基因小鼠构建及高表达系的筛选

目的：构建过表达pCAG?3×flag?PP2A Cα转基因小鼠,筛选高表达稳定遗传系,建立PP2A Cα基因相关功能研究模型动物。方法：将Flag蛋白标签序列与鼠源PP2A Cα cDNA 转录本设计成融合基因,插入CAG启动子下游,构建过表达载体pCAG?3×flag?PP2A Cα。通过原核显微注射技术,将线性化pCAG?3×flag?PP2A Cα质粒注射入受精卵雄原核,构建pCAG?3×flag?PP2A Cα过表达模型小鼠,PCR筛选阳性过表达小鼠。提取阳性过表达小鼠组织总蛋白,在蛋白质水平分析转基因小鼠3×flag?PP2A Cα的表达。结果：PCR 鉴定及测序结果证实,pCAG?3×flag?PP2A Cα 转基因载体及过表达pCAG?3×flag?PP2A Cα 转基因小鼠模型构建成功。Western blot筛选转基因高表达系小鼠。结论：筛选得到pCAG?3×flag?PP2A Cα高表达稳定遗传系小鼠。     

医学院校实验动物学教学改革实践与探讨

实验动物学作为生命科学研究的支撑学科,已在多院校开设课程,尤其是医学院校。但该课程的课程设计相对拘泥传统、偏重理论,不能很好地与自然科学的发展相适应。本文探讨从注重实践、与时俱进、定制授课等方面改革实验动物学的课程设置、授课内容、授课形式,以提升教学效果。