锰铅镉复合暴露对人神经母细胞瘤细胞的毒性作用

目的探索重金属复合暴露对人神经母细胞瘤(SK-N-SH)细胞的毒性效应。方法将SK-N-SH细胞分别暴露于空白培养基(对照)和氯化锰(125、250、500、750、1 000、1 500、2 000、4 000、6 000μmol/L),乙酸铅(500、750、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000μmol/L),氯化镉(5、10、15、20、30、40、60、80μmol/L)单一及二元、三元复合溶液24、48、96 h后,检测细胞存活率,计算锰、铅、镉的药物抑制浓度(IC)。其中,二元、三元复合溶液的浓度均为相应金属IC_(10)、IC_(20)、IC_(30)、IC_(50)的等毒效应比混合,分别用毒性单位法、混合毒性指数法对毒性效应进行评价。结果与对照组相比,不同浓度锰、铅、镉单独染毒不同时间SK-N-SH细胞的存活率均较低,除500μmol/L铅染毒24、96 h组和5μmol/L镉染毒24、48 h组外,差异均有统计学意义(P0.05);随着锰、铅、镉单独染毒浓度的升高和染毒时间的延长,SK-N-SH细胞的存活率均呈下降趋势。三种金属对SK-N-SH的细胞急性毒性依次为镉(IC_(50):38.728μmol/L)锰(IC_(50):442.739μmol/L)铅(IC_(50):1 624.850μmol/L)。同一金属不同染毒时间的IC_(50)排序均为96 h48 h24 h。锰和镉复合暴露对SK-N-SH细胞的联合毒性在24 h均表现为拮抗作用,在48 h均表现为协同作用;96 h在毒效应为IC_(10)、IC_(20)时均表现为部分相加作用,在IC_(30)、IC_(50)时均表现为协同作用。镉和铅对SK-N-SH细胞的联合毒性在24 h毒效应为IC_(10)、IC_(20)、IC_(30)时均表现为拮抗作用,在IC_(50)时表现为部分相加作用;在48 h毒效应为IC_(10)时表现为拮抗作用,在IC_(20)、IC_(30)、IC_(50)时均表现为部分相加作用;在96 h时均表现为部分相加作用。铅和锰对SK-N-SH细胞的联合毒性在24、96 h毒效应为IC_(50)时分别表现为简单相加、协同作用,其余均表现为部分相加作用。锰、铅、镉对SK-N-SH细胞的联合作用在24、96 h时均表现为部分相加作用;48 h时在IC_(10)、IC_(20)、IC_(30)均表现为协同作用,在IC_(50)时表现为部分相加作用。结论三种金属对SK-N-SH细胞的毒性均表现为随暴露时间的延长而增强的趋势。金属复合暴露呈现复杂的毒性效应,毒性效应与特定的金属组合、暴露时间、暴露浓度密切相关。     

PP2Ac去甲基化在BaP诱导HBE细胞恶性转化中的作用

目的探讨蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2Ac)去甲基化在苯并(a)芘(benzo[a]pyrene,BaP)诱导人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial,HBE)恶性转化中的变化及可能作用。方法用40μmol/L BaP处理人支气管上皮细胞,每周一次,共15周,构建BaP诱导的HBE细胞恶性转化模型,采用软琼脂试验和裸鼠成瘤试验鉴定恶性转化是否构建成功,使用蛋白免疫印迹(Western blot)分析比较恶性转化细胞和同期对照组细胞中PP2Ac去甲基化及其调节蛋白表达变化。结果软琼脂试验和裸鼠成瘤试验结果显示,经BaP处理后的细胞能在软琼脂中形成细胞集落,接种BaP诱导转化细胞的裸鼠可见肿块,说明恶性转化成功。蛋白免疫印迹(Western blot)检测蛋白表达发现,经BaP诱导恶性转化的HBE细胞和经100μmol/L BaP单次刺激24 h的HBE细胞与正常HBE细胞相比,总PP2Ac表达均无差异,亮氨酸羧基甲基转移酶1(LCMT1)表达均明显下降,蛋白磷酸酶甲基酯酶1(PME-1)和PP2Ac去甲基化(Dem-PP2Ac)表达均明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 PP2Ac去甲基化在BaP诱导细胞恶性转化中发挥作用,可能通过增强PP2Ac去甲基化促进BaP致肺癌发生。     

白脂素包涵体表达纯化及其功能评价

目的 构建白脂素的原核表达质粒，表达及纯化重组白脂素蛋白，并初步探索其功能，为进一步研究白脂素作用机制及其生理病理作用提供依据。方法 利用基因工程技术构建表达白脂素BL21菌株，经异丙基硫代半乳糖苷诱导，梯度尿素复性，亲和层析纯化及去内毒素处理得到可用于细胞和动物实验的重组白脂素。采用血糖仪检测重组白脂素腹腔注射后C57小鼠血糖变化情况。Alamar Blue检测重组白脂素作用24 h对MIHA细胞活性的影响；重组白脂素刺激MIHA细胞24 h，用蒽酮法检测糖原含量。结果 在37 ℃，A600 nm=0.8，IPTG终浓度为1 mmol/L诱导4 h目的蛋白表达效果较好。通过纯化和去内毒素处理，重组白脂素纯度大于95%，内毒素含量小于1 EU/mg，可以用于动物与细胞实验。腹腔注射重组白脂素60 min后C57小鼠血糖升高至峰值（重组白脂素组 vs 对照组P=0.021），120 min恢复到正常水平（重组白脂素组vs 对照组P=0.03）。重组白脂素刺激MIHA 细胞24 h，对细胞活性没有影响；检测糖原发现，不同浓度白脂素组糖原与对照组比较差异有统计学意义（P1=0.013，P2=0.036, P3=0.011）。结论 通过原核表达系统成功表达及纯化了白脂素蛋白，该方法纯化后的白脂素具有降低MIHA细胞糖原含量及升高小鼠血糖的作用，这为白脂素功能的进一步研究提供了理论依据。     

饮食限制对老龄大鼠脑组织PP2Ac去甲基化的影响

目的研究饮食限制对老龄大鼠脑组织PP2Ac去甲基化的影响。方法取健康SD雄鼠12只,随机分为老龄组6只和饮食限制组6只。老龄组动物自由饮食27个月;饮食限制组自12月龄时开始给予60%饮食限制,持续15个月。从大鼠12月龄开始每3个月测量1次体重;大鼠27月龄时通过Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力;WesternBlot检测2组大鼠大脑皮层及小脑总PP2Ac和PP2Ac去甲基化的蛋白表达。结果饮食限制组大鼠与老龄组大鼠相比体重明显下降,差异有统计学意义(P0.05);饮食限制组大鼠的学习能力较老龄组明显增强,差异有统计学意义(P0.05);饮食限制组大鼠大脑皮层、小脑PP2Ac去甲基化蛋白表达较老龄组明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。结论饮食限制在老龄大鼠脑组织中PP2Ac去甲基化水平下调。