一氧化氮合酶在慢性饮酒大鼠胃黏膜适应性细胞保护中的作用及其与乙醇体积分数的关系

目的：观察不同体积分数的乙醇刺激对慢性饮酒大鼠胃黏膜一氧化氮合酶活性的影响及其在适应性细胞保护作用中的意义。方法：实验于2004-09／2005-12在南京医科大学生理学系实验室进行。取健康雄性SD大鼠60只单纯随机分为6组，每组10只：正常对照组用自来水，其余5组分别以体积分数为0．01，0．03，0．06，0．12，0．24的乙醇水溶液作为大鼠饮水的惟一来源。在饮酒3d后，每组随机取7只动物，胃内灌注2mL的体积分数为1的乙醇，2h后和另外3只同时处死，观察大鼠胃黏膜的损伤情况（用损伤指数表示，评分越高，损伤越重），同时用免疫组化和反转录-聚合酶链反应方法观察各组大鼠胃黏膜一氧化氮合酶（包括神经型、内皮型和诱导型）及其mRNA的表达。结果：60只大鼠全部进入结果分析。①胃黏膜损伤指数：饮用体积分数为0．06，0．12乙醇组低于正常对照组（22&;#177;9，24&;#177;9，112&;#177;26，P〈0．05），前2组间比较差异无显著性意义；饮用体积分数为0．01，0．03和0．24乙醇组与正常对照组比较差异无显著性意义（P〉0．05）。②免疫组化染色结果：3种一氧化氮合酶的免疫组化阳性细胞在各组均有表达。③一氧化氮合酶mRNA的表达：内皮型一氧化氮合酶mRNA在各组大鼠的胃黏膜内的表达无规律；神经型一氧化氮合酶mR№在饮用体积分数为0．06，0．12乙醇组几乎无表达，而在其他几组均有表达，且表达量没有明显差别；而诱导型一氧化氮合酶mRNA仅在饮体积分数为0．12，0．24乙醇组有表达。结论：慢性饮酒大鼠胃黏膜的神经型一氧化氮合酶的表达下降可引起胃黏膜的适应性细胞保护作用并和饮用乙醇的体积分数有关。     

慢性酒精刺激对大鼠伏核EEG及脑电功率谱的影响

观察慢性酒精刺激过程中大鼠伏核EEG及功率谱的变化,探索酒精依赖的神经机制.在伏核埋植记录电极后,给大鼠饮用6%酒精水溶液30 d.用脑电图机及计算机信号采集系统记录及分析饮酒期间及停饮后的伏核EEG及功率谱.结果表明:在慢性饮酒过程中,d节律明显减小,散在的高幅慢活动δ波和θ波逐渐增多,功率谱分析表明δ频段功率百分比明显增加,而θ频段功率百分比明显减少,总功率减少.停饮后,出现棘波和棘慢综合波,并持续增多,δ频段功率百分比逐渐减少,而θ和α频段功率百分比逐渐增加,总功率增加,约在停饮9～10 d,脑电逐渐恢复正常.提示:伏核EEG和脑电功率谱的变化在一定程度上可反映慢性酒精刺激及撤除刺激对神经系统的影响.     

皮质醇对大鼠胃底腺主细胞个体发育的影响

目的外源性皮质醇可以使幼鼠的胃粘膜提前发育,本研究采用免疫组化和分子原位杂交技术,探讨皮质醇对主细胞个体发育的影响.方法各取Wistar大鼠6只分为实验组和对照组.实验组大鼠在出生后7,9,11d皮下注射醋酸可的松,剂量100mg/kg.对照组注射等量的生理盐水.在幼鼠出生后8,10,14,20,28d取出胃底腺,固定,包埋于石蜡及LowicrylK4M树脂.以胃蛋白酶原为主细胞标志物进行光镜及电镜的免疫组化染色和分子原位杂交.为区别主细胞成熟和不成熟的分泌颗粒,电镜染色中采用了胃蛋白酶原的抗体和PA-TCH-SP双重染色.结果实验组动物的免疫染色明显增强,染色阳性细胞数量明显增多,但阳性细胞的分布区域和对照组相一致.电镜染色发现,在出生3wk以前的大鼠,两组动物胃底腺均未发现典型的颈粘液细胞,实验组主细胞分泌颗粒的胃蛋白酶染色明显增强,但仍表现为未成熟颗粒的性质.在出生4wk以后的大鼠,实验组的颈粘液细胞和主细胞的未成熟分泌颗粒的胃蛋白酶染色明显增强,主细胞成熟分泌颗粒的胃蛋白酶染色未见明显改变.分子原位杂交的结果和免疫染色的结果相一致.结论外源性皮质醇可以使未成熟主细胞的胃蛋白酶mRNA表达增加,胃蛋白酶分泌量增加,但对主细胞的个体发育过程没有明显影响.     

大鼠伏隔核神经元膜特性及乙醇对其影响

目的:观察伏隔核神经元的膜特性及致醉剂量的乙醇(44 mmol/L)对其影响.方法:在大鼠伏隔核脑片上,采用细胞内电流钳记录技术.结果:所观察到的神经元包括五种类型,神经元的静息膜电位(mV)为-79.1±2.4,输入阻抗(MΩ)为48.4±2.3,锋电位的幅度(mV)平均为98.5±4.1;致醉剂量的乙醇(44 mmol/L)对大部分伏隔核神经元的膜电位、输入阻抗及I/V曲线无明显影响.结论:在伏隔核内,存在多种膜特性类型的神经元;致醉剂量的乙醇对大鼠伏隔核神经元的膜特性无明显影响,说明乙醇对伏隔核神经元的抑制作用主要并不是通过影响膜特性来实现的.     

慢性饮酒对大鼠胃粘膜细胞的凋亡与增殖的影响

目的 :研究大鼠慢性饮酒过程中胃粘膜的细胞凋亡和细胞增殖变化的规律 ,探讨慢性酒精刺激对胃粘膜的自我保护作用的影响。方法 :以 6% (V/V)的酒精作为大鼠饮水的唯一来源 ,利用流式细胞仪定量分析大鼠饮酒的不同时程内胃粘膜细胞的细胞周期和细胞凋亡 ,同时用免疫组化方法定性观察了大鼠胃粘膜的细胞增殖和凋亡情况。结果 :饮酒 3～ 2 8天的大鼠胃粘膜的细胞凋亡较对照组明显增加 ,在饮酒 3～ 14天的大鼠胃粘膜其细胞增殖也明显增加 ,提示在此时期内胃粘膜的细胞更新增强。结论 :长期低浓度酒精反复刺激可以促进胃粘膜的细胞凋亡并引起大鼠胃粘膜的自我保护作用减弱     

慢性饮酒大鼠胃粘膜的适应性细胞保护作用

目的：观察胃内灌注钝酒精对慢性饮酒大鼠胃粘膜的损害，并探讨慢性酒精刺激对大鼠胃粘膜细胞更新的影响及其在适应性细胞保护作用中的意义。方法：以6％（V／V）的酒精作为大鼠饮水的惟一来源，分别在大鼠饮酒的不同时程内胃内灌注100％酒精，观察大鼠胃粘膜的损伤情况。同时用免疫组化和计算机图像处理技术观察饮酒不同时程的大鼠胃粘膜的细胞增殖和凋亡，了解其细胞更新的情况。结果：100％酒精灌胃后大鼠胃粘膜的损伤和对照组相比，饮酒后1天的大鼠胃粘膜改变差异无显著性，饮酒后3－14天大鼠的胃粘膜损伤有显著性降低，饮酒后28天的大鼠差异又无显著性。饮酒3－14天的大鼠有粘膜的细胞增殖和凋亡同步增加，提示在此时期内胃粘膜的细胞更新增强。结论：适当低浓度酒精反复刺激可以促进胃粘膜的细胞更新并引起大鼠胃粘膜的适应性细胞保护作用。     

染料木黄酮对人乳腺癌细胞肌动蛋白细胞骨架和黏附能力的影响

目的:体外研究染料木黄酮(genistein)对人乳腺癌细胞(MDA-MB-435)肌动蛋白细胞骨架及黏附能力的影响.方法:不同浓度染料木黄酮(12.5、25.0、50.0和100.0 μmol/L)孵育MDA-MB-435细胞24 h.用FITC标记的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白,分别用荧光显微镜和流式细胞仪技术分析肌动蛋白细胞骨架的重组情况;噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞对人工重组基膜的黏附能力.结果:不同浓度染料木黄酮均导致细胞内肌动蛋白细胞骨架发生解聚,同时细胞内F-肌动蛋白排列和分布及细胞形态发生明显改变;此外,染料木黄酮可明显降低MDA-MB-435细胞对人工重组基膜的黏附能力,其效应呈剂量依赖性.结论:染料木黄酮在体外可抑制乳腺癌细胞的黏附能力,其作用可能与其诱导肌动蛋白细胞骨架重组有关.     

血管加压素对酒精戒断大鼠下丘脑-腺垂体-肾上腺皮质功能的影响

目的:观察在长期低浓度酒精处理及酒精戒断过程中,大鼠血浆中血管加压素(AVP)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇含量的变化以及下丘脑中AVP、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)含量的变化,进而探讨酒精对机体应激水平的影响以及AVP在酒精依赖过程中的作用。方法:以6%(V/V)的酒精作为大鼠饮水的唯一来源,分别饮酒1、3、7、14、21、28d,以及饮酒28d后撤除酒精2h,取不同处理大鼠的血浆和下丘脑标本,采用放射性免疫测定法分别测定CRF、AVP、ACTH和皮质醇水平;气相色谱法测定大鼠在饮酒过程中不同时段血中酒精浓度。结果:大鼠饮酒3d后,血浆中的AVP和皮质醇水平显著增高,并持续至饮酒结束,而血浆ACTH水平无明显变化。使用AVP受体拮抗剂后,血液中ACTH和皮质醇含量显著下降。动物血中酒精浓度在摄入酒精的不同时段无明显差异。结论:长时程的低浓度酒精刺激使机体应激水平升高,同时下丘脑-腺垂体-肾上腺皮质轴功能紊乱,这可能是动物产生酒精依赖的重要原因之一。     

ATP缺失时大鼠近端肾小管上皮细胞骨架重组与ERM蛋白的重分布相关

目的:探讨ATP缺失时大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞)肌动蛋白细胞骨架重组情况及其可能机制.方法:用含0.1 μmol/L antimycin A的ATP缺失缓冲液处理培养的NRK52E细胞,建立细胞的体外ATP缺失模型;采用FITC标记的鬼笔环肽标记纤维型肌动蛋白(F-actin),用流式细胞仪检测技术分析肌动蛋白细胞骨架的重组情况;用Western blot及免疫印迹技术检测ATP缺失后NRK52E细胞内骨架组分(Triton不溶组分)及上清组分(Triton可溶组分)中ERM(Ezrin/Radixin/Moesin)蛋白的分布改变.结果:体外ATP缺失模型建立,各实验组细胞内ATP浓度呈时间依赖性的下降(P＜0.05);ATP缺失后,NRK52E细胞内纤维型肌动蛋白的量渐增,且肌动蛋白的聚合程度随ATP缺失时间延长而增加(P＜0.05);ATP缺失后,ERM蛋白从细胞骨架解离进入胞浆,且ERM蛋白从细胞骨架的解离程度随ATP缺失的程度的增加而增加(P＜0.05).结论:ATP缺失后NRK52E细胞骨架重组可能与ERM蛋白的重分布相关.     

金雀异黄素对缺氧诱导的人ARPE-19细胞VEGF表达的抑制作用

目的:研究长期缺氧对体外培养的人ARPE鄄19细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的诱导作用,以及金雀异黄素(genistein,Gen)对其表达的影响初步研究。方法:使用半定量RT鄄PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ARPE鄄19细胞中VEGFmRNA和蛋白的表达,分析不同浓度Gen以及PD98059、TyrphostinA25对ARPE鄄19细胞缺氧24h诱导的VEGF表达的影响。结果:①正常对照组有少量VEGF表达,缺氧24h可明显提高ARPE鄄19细胞VEGFmRNA和蛋白的表达,分别为9.566±1.528和2.636±0.499倍;②Gen可明显抑制缺氧诱导ARPE鄄19细胞中VEGFmRNA和蛋白的表达,且呈浓度依赖性(P<0.05);③PD98059、TyrphostinA25也可抑制低氧诱导的VEGF的产生,但抑制作用没有Gen(200μmol/L组)明显。结论:Gen可抑制长期缺氧诱导的ARPE鄄19细胞VEGF表达,并可能是通过抑制p42/p44MAPK途径和HIF鄄1途径共同抑制VEGF的产生,提示Gen对视网膜新生血管的形成具有预防和潜在的临床治疗价值。