Hsp16.3的生物学特性及其在结核病研究中的应用

Hsp16．3是由结核分枝杆菌（M.tuberculosis，MTB）hspX基因（Rv2031c、acr）编码的蛋白，最初被认为是免疫显性抗原，后来被确认是一个重要的膜抗原，它的表达与MTB的休眠密切相关。     

解放军疾控所SPF动物房的工艺设计

解放军疾病预防控制所,为履行职能和任务,在业务办公大楼12层建设了SPF动物实验设施,面积约240 m2。文章介绍了作者的设计思路和建设方案。同时还介绍了SPF动物房的建设经验。     

Hsp65与IL-2融合蛋白诱导小鼠细胞免疫应答及保护力

目的 研究Hsp65与hIL-2的融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力.方法 在大肠杆菌中诱导表达Hsp65与hIL-2的融合蛋白,通过Ni-NTA亲合柱纯化后的蛋白经鉴定后,与佐剂DDA和MPL联合免疫小鼠,连续免疫3次,每次间隔2周,最后一次免疫结束后两周,分离5只小鼠脾淋巴细胞,测定淋巴细胞增殖指数,IFN-γ和IL-2水平,以及特异性淋巴细胞杀伤功能,其余5只免疫小鼠用于MTB毒株攻击实验.结果 获得融合蛋白可分别与抗Hsp65和抗hIL-2的单抗发生特异性反应.融合蛋白免疫小鼠后,小鼠脾淋巴细胞被有效活化,诱导产生的γ-IFN和IL-2的水平以及CTL杀伤功能均显著高于BCG和单纯Hsp65免疫组(P<0.05).融合蛋白免疫组可有效抵抗MTB毒株攻击,脾脏细菌数显著减少(4.36±0.48),提供的保护力与BCG相当(4.30±0.53).结论 Hsp65与hIL-2的融合蛋白是一种有效的亚单位疫苗,可用于TB的预防.     

结核分枝杆菌HSP 65亚单位疫苗和基因疫苗的构建及免疫学特性

目的:构建HSP 65蛋白的亚单位疫苗和基因疫苗,并与BCG相比较,评价这两种疫苗在小鼠体内的免疫学特性.方法:从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出hsp 65基因,连接进入pMD18-T载体中,测序后,利用不同酶切位点将完整的hsp 65基因分别克隆到pProEX HTb原核表达载体和pcDNA3.1(-)真核表达载体,前者在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot分析后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化;后者通过阳离子聚合物瞬转P815细胞,用间接免疫荧光检测细胞内HSP 65蛋白的表达.用上述原核表达蛋白和真核质粒(分别为亚单位疫苗和基因疫苗)免疫BALB/c小鼠,ELISA测定特异性抗体的滴度,MTT测定脾淋巴细胞特异性增殖指数.结果:获得的结核分枝杆菌hsp 65基因序列与GenBank公布的完全一致;Western Blot结果显示,在M<,r>约65000处有与鼠抗HSP 65 mAb和临床结核患者血清的特异性结合带;免疫荧光结果显示转染重组质粒的P815细胞的表达蛋白与HSP 65 mAb有特异性结合.两种疫苗免疫小鼠体内产生特异性抗体,经蛋白刺激后可引起脾淋巴细胞特异性增殖.结论:所构建的两种疫苗能引起免疫动物的特异性体液和细胞免疫反应,应进一步研究其抵抗结核分支杆菌感染的保护力机制,以用于结核病的防治研究.     

CD46在小鼠脑缺血再灌注损伤中的表达和意义

目的观察补体调节蛋白CD46在小鼠脑缺血．再灌注损伤过程中的表达变化情况,探讨其在脑缺血-再灌注损伤中的可能意义。方法采用线栓法制备小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型,缺血1h后再灌注。记录脑组织病理的动态变化,应用免疫荧光组织化学法及荧光定量PCR法检测脑内补体调节蛋白CD46的表达变化。结果脑组织病理损伤在再灌注后24h达最重,脑内补体调节蛋白CD46的表达水平逐渐减少,至再灌注后24h达最低,再灌注96h基本恢复正常。补体调节蛋白CD46表达水平与脑组织病理损伤呈负相关。结论脑缺血-再灌注后补体调节蛋CD46的表达水平发生显著变化,推测其可能参与脑缺血-再灌注后的免疫损伤过程,通过调节补体调节蛋nCD46的激活可为治疗脑缺血-再灌注损伤提供参考。     

雌二醇诱导雌性大鼠真性性早熟模型的建立

目的应用17β-雌二醇(E2)建立雌性大鼠真性性早熟模型。方法 15日龄雌性SD仔大鼠采用ig给予雌二醇50μg.kg-1连续5 d制备性早熟模型。观察大鼠阴门开启平均日龄(VO)、第一个发情间期出现的平均日龄(D1)和性周期稳定后第一个发情期出现的平均日龄(E1);测定血清中黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)和雌激素(E2)水平;计算子宫、卵巢和阴道指数;逆转录PCR法测定下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)、Kiss-1、G蛋白偶联受体54(GPR54)mRNA和垂体GnRH受体(GnRHR)mRNA表达水平。结果 与溶剂对照组比较,模型组大鼠VO,D1和E1分别提前了14.6 d,14.5 d和11.3 d(P<0.05),阴道指数相对升高了151%(P<0.05);模型组大鼠血清中LH,FSH和E2水平明显升高(P<0.05);GnRH,Kiss-1,GPR54和GnRHR mRNA表达量均显著增加(P<0.05)。结论 应用17β-雌二醇可以使雌性大鼠正常的性发育提前,可以考虑用于建立真性性早熟模型。     

藤黄微球菌复苏促进因子结构域及其突变体基因的克隆和表达及生物活性的测定

目的 克隆、表达藤黄微球菌复苏促进因子(Rpf)结构域及其突变体基因,评价其生物学活性.方法 采用PCR方法从藤黄微球菌基因组中扩增出Rpf结构域及其突变体基因E54A、E54K,用限制性内切酶消化后克隆入pMD-18T载体中,将测序正确的基因插入到pGEx-4T-1表达载体中,转化大肠杆菌DH5α,经异丙基-B-D硫代半乳糖(IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达蛋白,利用Rpf结构域单克隆抗体进行Western blot分析.用GS-4B亲和层析柱纯化蛋白,将纯化的蛋白加人到休眠的耻垢分枝杆菌中测定各自的生物活性.结果 获得藤黄微球菌Rpf结构域及其E54K和E54A突变体基因,测序结果 与美国基因序列数据库GenBank公布的序列完全相同,突变位点与设定一致;表达蛋白相对分子质量与文献报道一致;Western blot结果 显示,在相对分子质量约32 000处有与Rpf结构域单克隆抗体特异性结合带.通过GS-4B系统,得到纯化的GST融合蛋白,并证实Rpf结构域蛋白对休眠的耻垢分枝杆菌有一定的复苏和促生长作用,突变体E54K对耻垢分枝杆菌的生长有抑制作用.结论 获得Rpf结构域及其2种突变体蛋白,明确其对耻垢休眠菌有复苏的作用.     

婴幼儿肠套叠69例诊治体会

肠套叠是婴幼儿常见疾病，早期肠套叠空气整复治疗取得良好疗效、从而降低了手术率。我院自1989～1996年收治69例现报告如下。1临床资料1．l一般资料。本组69例，男53例，女16例。年龄7～18个月。患儿发病较高，年龄最小者7个月，发病时间最短者1．5个月。1．2临床表现。69例肠套叠发病初期均有阵发性腹疼或哭闹。80％者有血便、而小肠会叠大部分无血便出；75％有呕吐和腹部包块，但晚期肠套叠腹胀明显则不易触及色块，有腹膜刺激症状和发热9例，中度腹水者4例，因肠坏死肠切除肠吻合者3例。2讨论2．l肠套叠的病因。可分为原发性与继发性两…     

结核分枝杆菌Hsp65的表达、纯化与鉴定

目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌热休克蛋白65(Heat Shock Protein 65),为研究结核病诊断技术提供基础。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中分两段扩增出hsp65基因,将上下游基因片段分别连接进入pMD18-T载体中,序列测定正确后,通过基因内部的单一酶切位点进行连接。将完整的hsp65基因克隆到pProEX HTa载体并在大肠杆菌DH5α中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。获得的纯化蛋白与10例临床可疑结核病人血清进行Western-blot分析。结果获得的结核分枝杆菌Hsp65基因序列与GenBank公布的一致;表达蛋白相对分子质量为65 kDa,与文献报道相同;Western-blot结果显示,在相对分子量约65 kDa处与鼠抗MTB Hsp65 mAb特异性结合带;纯化的目的蛋白与8例病人血清有特异性结合条带,2例为阴性,该结果与临床诊断一致。结论成功表达、纯化和鉴定了Hsp65蛋白,为其在结核病诊断研究中的应用奠定了基础。     

基准剂量法在长期暴露毒性评价中的研究进展

风险评估是为了评价特定危害因素下的人群暴露水平。传统毒性分析方法常采用未观察到有害作用剂量（ NOAEL）对毒性结果进行定量,除以不确定系数,以外推得到人群的安全摄入水平（ ADI）和参考剂量（ RfD）。多年实践证明,NOAEL法过多依赖实验设计,在安全性评价应用中存在诸多局限性。基准剂量（ BMD）法是一种新的确定RfD的方法,具有诸多优点,能更科学地进行风险评估。该文综述了BMD法原理及分析软件、与NOAEL相比的优点、在长期暴露毒性实验中应用及方法完善等的研究进展,为后期在长期暴露毒性实验及其他化合物风险评估中的应用提供相关参考。