小鼠胚胎心流出道心内膜垫的形成与融合

目的观察不同发育时期小鼠胚胎心流出道心内膜垫的发育过程。方法对胚龄9-12d小鼠胚胎心脏连续切片进行HE染色和免疫组化染色。结果胚龄10d,流出道远端心胶质内开始观察到间充质细胞。胚龄11d,两侧流出道心内膜垫形成,心内膜垫内部分间充质细胞染色呈α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性。胚龄12d,两侧流出道心内膜垫内部分间充质细胞聚集形成致密漩涡状结构,随着心内膜垫融合,两侧漩涡状结构融合。结论小鼠胚胎流出道心内膜垫形成于胚胎发育第11天,第12天融合,间充质细胞参与心内膜垫融合。     

数码显微摄影中应注意的几个方面

结合实践介绍了数码显微摄影系统应用和显微镜调节中应注意的几个方面,指出要获得一幅满意的图像需要制作出优质的标本、恰当调节显微镜和合理使用成像软件三者的有机结合。     

胆囊收缩素和胰高血糖素在发育小鼠胰内的表达

目的:观察发育中小鼠胰内的胆囊收缩素免疫阳性(CCK-IR)细胞和胰高血糖素免疫阳性(Glu-IR)细胞.方法:用免疫组织化学SP法观察胚胎11 d至出生后45 d小鼠胰内的CCK-IR 细胞和Glu-IR 细胞的发生、分布、形态和数量变化.并用免疫组织化学双重显色观察胰内CCK与Glu在同一细胞中共存的现象.结果:小鼠胚胎第12日,在早期分化的胰中出现CCK-IR细胞和Glu-IR细胞.CCK-IR细胞的数量于胚胎15 d达高峰,出生后胰中仅偶见CCK-IR细胞.胚胎期Glu-IR细胞数量逐渐增加,出生1周内数量下降,而后再次显著增加.免疫组织化学双重显色小鼠胚胎期胰内可见CCK-Glu-IR细胞.结论:小鼠胰内的CCK-IR细胞可能以内分泌和旁分泌的方式刺激胰的生长、分化和发育;CCK-Glu-IR细胞可能是胰中比较原始的内分泌细胞.     

甘油二酯激酶ζ在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达

目的研究肝癌组织和人肝癌细胞系中甘油二酯激酶ζ(diacylglycerol kinase,DGKζ)和蛋白激酶C(PKC)的表达及意义。方法应用免疫组织化学和细胞化学法检测DGKζ和PKC在60例肝癌与癌旁组织、10例正常肝组织和体外培养的正常人肝细胞系、癌旁肝细胞系和人肝癌细胞系的表达情况,对肝癌组织中DGKζ和PKC的表达进行相关性分析。结果 DGKζ在正常肝组织呈阴性表达,在癌旁组织肝细胞胞质和肝癌细胞的细胞膜上有阳性表达;肝癌组织中DGKζ的阳性率为86.7%(52/60),显著高于癌旁组织(40/60,χ2=6.708,P=0.010)和正常肝组织(阴性,χ2=33.704,P<0.000 1)。PKC表达在正常肝细胞的胞质和胞核、癌旁组织肝细胞的细胞膜和肝癌组织的胞质或胞膜;肝癌组织中PKC的阳性率为71.7%(43/60),与癌旁组织61.7%(37/60,χ2=1.350,P=0.245)和正常组织100.0%(10/10,χ2=3.742,P=0.104)相比无统计学差异,癌旁组织中PKC的阳性率显著低于正常肝组织(χ2=5.709,P=0.025)。肝癌组织中DGKζ与PKC的表达呈正相关(r=0.296,P=0.022);DGKζ和PKC均主要表达在三种细胞系肝细胞的胞质。结论 DGKζ主要在肝癌组织被激活,可能有抑制肝癌细胞增殖的作用。     

小鼠胚胎心流出道的形态发生与呼吸内胚层发育耦联

目的 探讨小鼠胚胎心发育过程中前肠呼吸内胚层与第一生心区和第二生心区及胚胎心流出道的形态发生关系。方法 胚龄7.5～13d小鼠胚胎心各3个,连续石蜡切片,用抗胰岛素增强子结合蛋白1（ISL-1）、抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗Nkx2.5和抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体进行免疫组织化学或免疫荧光染色。结果 胚胎发育7.5d,ISL-1在生心板心肌前体细胞表达并与发育中的第二生心区ISL-1阳性细胞连续。胚胎发育第10～13天, 可见ISL-1强阳性的前肠腹侧呼吸内胚层细胞增生,排列不规则,     

甘油二酯激酶γ参与大鼠胚胎脑神经上皮细胞的发育

目的探讨甘油二酯激酶γ(DGKγ)在大鼠胚胎脑神经上皮发育中的作用及可能机制。方法 18只胎龄(E)11.5、E12.5、E14.5、E16.5、E18.5大鼠胚胎用于Western blotting方法检测DGKγ在大鼠胚胎脑组织的表达,E9.5~E18.5大鼠胚胎各5只用于免疫组织化学和免疫荧光染色方法检测DGKγ在大鼠胚胎脑的分布以及DGKγ与Ki67、乙酰胆碱转移酶(Ch AT)及酪氨酸羟化酶(TH)的细胞内共定位。结果 DGKγ蛋白含量在E11.5~E14.5表达逐渐增多,E16.5表达较E14.5显著减少,E18.5表达显著增多且高于E14.5水平。E10.5~E12.5,DGKγ在脑泡壁出现表达,并随着脑泡的发育表达在端脑、除大脑脚外的中脑、后脑和末脑;E13.5~E14.5,DGKγ的强阳性表达从海马及周围的新皮质、苍白球、嗅脑和大脑脚阳性延伸到除新皮质外的脑的各区域;E15.5至出生前,DGKγ在新皮质阳性表达增强,但在大脑脚和脑桥表达减弱。免疫荧光染色显示,E14.5,与海马和苍白球相比,嗅脑的DGKγ阳性细胞中Ki67阳性率较高(87%),Ch AT阳性率较低(9%)(均P0.05),中脑顶盖的DGKγ阳性细胞中62%为TH阳性;E16.5,新皮质的DGKγ阳性细胞中Ki67阳性率为26%,较E14.5时(49%)显著降低(P0.05),Ch AT阳性率为70%,较E14.5时(45%)显著增高(P0.05);DGKγ多位于神经上皮细胞的胞质,也可见于胞膜上,或者同时位于胞质和胞核。结论 DGKγ在胚胎脑的表达模式和亚细胞分布,提示其参与了胚胎脑神经上皮的增殖、迁移和分化后神经元的发育。     

小鼠胚胎心脏流出道嵴的发育

目的探讨小鼠胚胎心脏流出道嵴内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性细胞的来源及流出道嵴融合时间充质细胞超微结构的变化。方法用抗α-SMA、抗α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)单克隆抗体、PlexinA2探针,对胚龄10～14d小鼠胚胎心脏切片进行免疫组织化学和原位杂交染色;透射电镜观察胚龄12.5d时小鼠心流出道嵴的融合过程。结果胚龄10～11d,小鼠神经管及其周围、动脉囊和弓动脉壁可见PlexinA2阳性细胞,并沿动脉囊壁迁入流出道嵴内,部分细胞同时表达α-SMA。胚龄12d,PlexinA2阳性细胞分布在脊神经节、咽前间充质、主肺动脉隔以及主、肺动脉壁。主肺动脉隔显α-SMA强阳性,但动脉壁仅见少量α-SMA阳性细胞。胚龄12.5d,流出道嵴内致密间充质细胞团形成并开始融合,PlexinA2表达较弱,α-SMA表达呈强阳性。在流出道嵴融合开始后,嵴表面的内皮细胞带形成继而断裂消失,由含微丝少、排列稀疏的间充质细胞取代。两侧致密细胞团逐渐靠拢、融合。有的间充质细胞内含较多线粒体和微丝,细胞之间形成细胞连接点;有的间充质细胞含微丝少,细胞膜间断融合。结论流出道心内膜垫内α-SMA阳性间充质细胞来自神经嵴;内皮细胞-间充质细胞转化可能参与了流出道嵴融合;致密细胞团内间充质细胞富含微丝束和细胞连接点或发生细胞膜融合有助于流出道嵴的融合。     

小鼠生精细胞发育特异基因spafa3的表达分析和克隆纯化冰

背景:雄性哺乳动物生精细胞自发性或诱发性凋亡现象与细胞凋亡相关基因有着密切的联系.spata3是一个新发现的小鼠生精细胞凋亡相关基因.目的:探讨小鼠生精细胞发育特异基因spata3的表达特性,制备高纯度的可溶性GST-SPATA3融合蛋白.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-10/2008-08在山西医科大学生物化学与分子生物学实验室和组织学与胚胎学实验室完成.材料:pMD19-T Simple克隆载体及大肠杆菌菌株E.coli DH5α(TaKaRa公司),表达载体pET-41a(+)plasmid DNA(Novagen公司),大肠杆菌菌株E.coil BL21(DE3)(Solarbio公司);1,2,3,5,8周龄雄性和8周龄雌性BALB/c小鼠.方法:麻醉后颈椎脱臼处死小鼠,取出各小鼠的睾丸组织和8周龄小鼠的火脑、心脏、肝脏、肺、肾脏、脾脏、卵巢、子宫,提取各组织总RNA.通过聚合酶链反应、定量聚合酶链反应和原位杂交研究spata3 mRNA表达及定位:通过构建原核表达载体,诱导并纯化蛋白,制备抗体.主要观察指标:①反转录-聚合酶链反应分析spata3组织特异性表达.②荧光定量聚合酶链反应分析spata3的阶段特异性表达.③spata3 mRNA细胞定位的杂交信号.④SPATA3重组蛋白在原核细胞的表达及其纯化.⑤重组蛋白的Western blot 分析.结果:反转录-聚合酶链反应表明spata3具有显著的睾丸组织特异性表达特征;实时定量聚合酶链反应显示spata3在精子发生后期高表达,可能与精子细胞的变态成形过程密切相关;原位杂交证明spata3转录本主要定位在圆形和长形精子细胞内,进一步提示该基因参与了精子细胞发育后期的形态变化.DNA序列测定和SDS-PAGE分析证明spata3原核表达载体构建成功并可被商效诱导表达;Western blot印迹杂交显示纯化的SPATA3重组蛋白具有高度的特异性.结论:spata3是小鼠睾丸组织特异表达的精子发生相关基因,在圆形和长形精子细胞中处于高水平转录状态;实验获得的高纯度可溶性融合蛋白完全满足后期抗体制备的需要.     

甘油二酯激酶ζ、蛋白激酶Cδ和Tis21在发育中大鼠脑的表达和定位

目的探讨甘油二酯激酶ζ(DGKζ)、蛋白激酶Cδ(PKCδ)和Tis21在大鼠胚胎脑的时空表达模式以及与脑发育的关系。方法胚龄(E)9.5~E18.5大鼠胚胎各5只,连续切片用于免疫组织化学方法检测DGKζ、p-PKCδ和Tis21在大鼠胚胎脑的表达;22只胚龄E11.5、E12.5、E14.5、E16.5和E18.5大鼠胚胎用于Western blotting,检测DGKζ、磷酸化PKCδ(p-PKCδ)、PKCδ和Tis21在大鼠胚胎脑组织的表达。结果免疫组织化学显示,于E9.5 p-PKCδ和Tis21在神经沟神经上皮呈阳性表达,DGKζ为阴性;E10.5~E11.5,DGKζ、p-PKCδ和Tis21在脑泡壁均呈阳性表达;在E12.5三者均表达于端脑、间脑、中脑腹侧和脑桥处神经上皮,而中脑背侧、峡部和小脑原基仅DGKζ呈阳性表达,p-PKCδ和Tis21呈阴性;于E13.5三者沿海马、隔、苍白球及嗅脑呈阳性分布,在新皮质呈阴性,p-PKCδ和Tis21在峡部和小脑原基出现阳性表达;于E14.5 DGKζ表达延伸到新皮质,在脑的各个区域呈现出全阳性。而p-PKCδ和Tis21表达仅延伸到中脑顶盖,在新皮质仍为阴性;于E15.5 p-PKCδ和Tis21在新皮质出现阳性表达,在脑的各个区域均呈阳性;E16.5~E18.5,三者在小脑和脑桥表达范围缩小;DGKζ和p-PKCδ可表达在神经上皮细胞的胞质,或胞质和细胞核。Western blotting显示,DGKζ和Tis21在E11.5~E14.5表达逐渐增多,E12.5较E11.5显著增多,在E16.5和E18.5逐渐下降;p-PKCδ/PKCδ显示PKCδ活性变化趋势与DGKζ表达趋势一致。结论 DGKζ、p-PKCδ和Tis21时空表达与脑发育模式一致,DGKζ和p-PKCδ在神经上皮细胞的亚细胞分布提示它们主要通过DGKζ/Tis21和PKCδ/Tis21途径参与脑的发育。     

小鼠生精细胞发育特异基因spata3的表达分析和克隆纯化

背景：雄性哺乳动物生精细胞自发性或诱发性凋亡现象与细胞凋亡相关基因有着密切的联系。spata3是一个新发现的小鼠生精细胞凋亡相关基因。 目的：探讨小鼠生精细胞发育特异基因spata3的表达特性,制备高纯度的可溶性GST-SPATA3融合蛋白。 设计、时间及地点：观察性实验,于2007-10/2008-08在山西医科大学生物化学与分子生物学实验室和组织学与胚胎学实验室完成。 材料：pMD19-T Simple克隆载体及大肠杆菌菌株E.coli DH5α (TaKaRa公司),表达载体pET-41a (+) plasmid DNA (Novagen公司),大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)(Solarbio公司);1,2,3,5,8 周龄雄性和8 周龄雌性BALB/c小鼠。 方法：麻醉后颈椎脱臼处死小鼠,取出各小鼠的睾丸组织和8周龄小鼠的大脑、心脏、肝脏、肺、肾脏、脾脏、卵巢、子宫,提取各组织总RNA。通过聚合酶链反应、定量聚合酶链反应和原位杂交研究spata3 mRNA表达及定位;通过构建原核表达载体,诱导并纯化蛋白,制备抗体。 主要观察指标：①反转录-聚合酶链反应分析spata3组织特异性表达。②荧光定量聚合酶链反应分析spata3的阶段特异性表达。③spata3 mRNA细胞定位的杂交信号。④SPATA3重组蛋白在原核细胞的表达及其纯化。⑤重组蛋白的Western blot分析。 结果：反转录-聚合酶链反应表明spata3具有显著的睾丸组织特异性表达特征;实时定量聚合酶链反应显示spata3在精子发生后期高表达,可能与精子细胞的变态成形过程密切相关;原位杂交证明spata3转录本主要定位在圆形和长形精子细胞内,进一步提示该基因参与了精子细胞发育后期的形态变化。DNA序列测定和SDS-PAGE分析证明spata3原核表达载体构建成功并可被高效诱导表达;Western blot印迹杂交显示纯化的SPATA3重组蛋白具有高度的特异性。 结论：spata3是小鼠睾丸组织特异表达的精子发生相关基因,在圆形和长形精子细胞中处于高水平转录状态;实验获得的高纯度可溶性融合蛋白完全满足后期抗体制备的需要。