HBC通过NEU1调控肝癌细胞中基因表达的初步研究

目的探讨乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B virus C protein,HBC)对唾液酸酶1(neuraminidase 1,NEU1)及相关基因表达的影响。方法通过脂质体将pcDNA3.1和pcDNA3.1-HBC质粒分别转染HepG2细胞和Huh7细胞,采用Quantitative real-time-PCR(q-PCR)及Western blot检测NEU1的表达;PCR扩增NEU1基因并与pcDNA3.1载体质粒连接,构建NEU1过表达质粒pcDNA3.1-NEU1;将pcDNA3.1-NEU1和对照质粒分别转染HepG2细胞,收集细胞,进行转录组测序,获得差异表达基因,用q-PCR对差异表达基因进行验证;将pcDNA3.1-HBC和对照质粒转入肝癌细胞,q-PCR检测HBC对NEU1相关的差异表达基因的影响;在HBC阳性肝癌细胞,利用NEU1的小干扰质粒抑制其表达,q-PCR检测HBC是否通过NEU1调控相关基因的表达。结果与对照组肝癌细胞相比,转染HBC质粒的肝癌细胞NEU1表达显著上调;PCR鉴定pcDNA3.1-NEU1插入片段正确,重组质粒构建成功;转录组测序显示,与对照组比较,过表达NEU1的HepG2细胞有8个基因表达显著不同,其中6种基因表达上调,2种基因表达下调;q-PCR检测转录组测序获得的差异表达基因与转录组测序的结果一致;与对照肝癌细胞相比,NEU1相关的上调差异表达基因在HBC阳性肝癌细胞中高表达,且干扰NEU1表达后以上基因在HBC阳性肝癌细胞中表达下调;与NEU1相关的下调差异表达基因在HBC基因组中低表达,且干扰NEU1表达后相关基因在HBC阳性肝癌细胞中表达上调。结论HBC能够通过NEU1调控肝癌细胞中相关基因的表达。     

开设微生物学与免疫学综合性实验教学的体会

医学微生物学与免疫学是一门重要的医学基础课,具有较强的实践性和应用性。实验教学是其重要的组成部分,是理论联系实际的重要环节。在实验教学中增加综合性实验的内容,有效的提高了学生综合运用理论知识和实验技能分析和解决实际问题的能力、培养学生的创新意识、创新能力和科研思维方式,有助于进一步提高教学质量,培养实用型人才。     

JNK磷酸化Bad在脑缺血神经元凋亡中的作用

目的探讨JNK磷酸化Bad在大鼠缺血性神经元凋亡中的作用。方法 20只大鼠均分为4组：假手术组、缺血复灌组、溶剂对照组和SP600125组。制作大鼠全脑缺血模型,应用免疫沉淀和免疫印迹法检测大鼠脑缺血复灌1 d海马CA1区神经元Bad与14-3-3及Bad与Bcl-Xl的结合、Bad丝氨酸128位磷酸化[p-Bad（S128）]水平、Caspase-3蛋白表达情况。结果与缺血复灌组相比,SP600125组海马CA1区神经元Bad与14-3-3的结合明显增高,Bad与Bcl-Xl的结合、p-Bad（S128）、Caspase-3表达显著减少（均P〈0.05）。结论 JNK介导的Bad（S128）磷酸化在大鼠缺血性脑损伤中发挥了重要作用。     

乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3．1-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV中,得到pAdTrack—CMV—HBx,将其PmeI酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd—HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad—HBx。结果、PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad—HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础。     

乙肝病毒X基因对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙肝病毒X基因(hepatitis B virus,HBX)对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将HBX真核表达载体pcDNA3.1-X转人人肝癌细胞HepG2中,建立表达HBX的HepG2/HBX细胞模型;以转染空载体pcDNA3.1的HepG2/pcDNA3.1细胞为对照,于转染后24、48、72、96 h收集细胞标本,行流式细胞术分析肝细胞凋亡率变化情况,RT-PCR、Western blot分别检测肝癌细胞内HBX和凋亡相关基因Fas、FasL表达以及JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平情况.结果 转染24 h后HepG2/HBX细胞中即检测出HBX表达,且其表达量随时间延长而逐渐增高(P＜0.05);对照组细胞中各时间点均无HBX的表达.转染后各时间点,HepG2/HBX细胞与对照组细胞相比,细胞凋亡率均升高(P＜0.05),Fas、FasL表达量和JNK、c-Jan蛋白磷酸化水平亦均增高(P＜0.05);且HBX mRNA表达量与细胞凋亡率、Fas和FasL表达量以及JNK、c-Jun的磷酸化水平均呈正相关(P＜0.05).结论 HBx可通过上调JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平而促进FasL蛋白的表达,从而诱导HepG2细胞凋亡.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白表达及条件优化

目的:优化肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白表达条件,探索包涵体复性和纯化方法。方法:用IPTG诱导pGEX-6P-1/TRAIL在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物经稀释复性和透析复性法使GST-rTRAIL蛋白恢复天然构象;并运用Glutathione-Superflow Resin亲和层析柱纯化GST-rTRAIL目的蛋白,Western blotting分析目的蛋白。结果:GST-rTRAIL在大肠杆菌BL21(DE3)中表达约40 kDa的蛋白条带,与预期值相符,该蛋白以包涵体形式存在;0.2 mmol.L-1IPTG 37℃诱导8 h时,全菌蛋白表达量最高;复性后的蛋白溶液经Glutathione-Superflow Resin亲和层析纯化获得纯的目的蛋白,Western blotting显示能被鼠抗GST的标签抗体识别。结论:本实验结果显示IPTG浓度为0.2 mmol.L-1,37℃诱导8 h,GST-rTRAIL全菌蛋白的表达量最高;GST-rTRAIL蛋白包涵体经稀释复性、透析复性和Glutathione-Superflow Resin亲和层析柱分离纯化获得目的蛋白,为进一步研究其生物学功能及临床应用奠定基础。     

CBL应用于医学微生物理论教学的初步探索

针对医学微生物学的课程特点,对五年制临床医学的部分学生采用CBL教学,并比较CBL与LBL的教学效果。结果表明,CBL组学生的表达能力、自主学习能力、创新思维能力、团队协作能力明显提高,可为医学微生物学教学改革提供借鉴。     

人可溶性TRAIL蛋白表达及纯化条件优化

目的：优化人可溶性TRAIL蛋白生产菌发酵及纯化条件,从而提高TRAIL的产量及活性。方法①探索6种不同培养液、培养液pH值、异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导浓度及时间,选择最佳发酵条件;②联合镍离子亲和层析及超滤法纯化人可溶性TRAIL蛋白。结果①人可溶性TRAIL的最佳发酵条件为pH7．4的YPD培养液,所用IPTG的最佳浓度为0．2 mmol/L,最佳诱导时间为6 h;②经镍离子亲和层析和超滤联合作用可得纯度极高的蛋白。结论成功完成了人可溶性TRAIL发酵及纯化条件的优化,为今后大量提取TRAIL蛋白奠定了基础。     

HL7702-HBX与HepG2-HBX细胞株的建立及鉴定

目的建立稳定、高效的HBx蛋白体外表达细胞株。以便进一步研究HBX基因和HBx蛋白的致癌作用及机理。方法建立HBX真核表达载体pcDNA3．1-HBX,通过脂质体介导将pcDNA3．1-HBX转染到人正常肝细胞株HL7702及人肝肿瘤细胞株HepG2中。结果RT-PCR、蛋白质印迹及免疫荧光的实验结果显示,HBX基因在人正常肝细胞株HL7702及人肝肿瘤细胞株HepG2中得到了表达。结论成功构建了表达HBx蛋白的HL7702-HBX与HepG2-HBX细胞株,为进一步研究HBX基因和HBx蛋白的致癌作用及机制奠定了实验基础。     

乙型肝炎病毒X基因对正常肝细胞HL7702凋亡影响的初步探讨

目的 研究乙型肝炎病毒X基因(HBX基因)对HL7702肝细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响.方法 用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3.1( )-X瞬时转入HL7702细胞,以转染空质粒pcDNA3.1( )的细胞及未转染的HL7702细胞为对照.转染后72 h收集细胞标本,作以下处理:RT-PCR法检测HBX mRNA的表达,免疫荧光鉴定HBx蛋白的表达;流式细胞术检测细胞凋亡率;以β-actin为内参,半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA的表达量变化.结果 转染72h后,转染pcDNA3.1( )-X真核表达载体的HL7702细胞经RT-PCR扩增出HBX片段,免疫荧光结果 显示细胞内出现HBx蛋白的较强荧光;而转染空质粒组及未转染对照组经RT-PCR法及免疫荧光检测均显示无HBx表达.通过流式细胞术和半定量RT-PCR法检测细胞凋亡情况,结果 显示:转染HBX的细胞凋亡率(3.38%±0.67%)相对于转染空质粒组(1.25%±0.30%)及未转染质粒组(1.40%±0.37%)凋亡率增高, 差异均有显著性意义(P<0.05);转染HBx的细胞Bax mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差异均有显著性意义(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显降低,差异均有显著性意义(P<0.05).转染空质粒组和未转染质粒组之间,对细胞凋亡率、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA进行比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论成功将HBX转染入HL7702细胞,并在细胞中表达;转染后72 h HBx可上调Bax表达,而下调Bcl-2表达,表明HBx能促进HL7702细胞凋亡.