外源性 AFP 对肝癌细胞增殖和抗凋亡的作用研究

目的：探讨外源性甲胎蛋白（ AFP）对体外培养的肝癌细胞系的生物学功能及意义。方法该实验选用了HepG2（AFP阳性）和HLE（AFP阴性）两种常见的肝癌细胞系,再加入不同浓度的外源性AFP处理24 h后,用MTT检测细胞的增殖情况;在这两种细胞系中加入凋亡诱导剂ATRA处理的同时加入外源性AFP,检测AFP对于细胞的抗凋亡能力的影响。结果在HepG2和HLE细胞中,加入不同浓度的外源性AFP后, MTT结果显示AFP可以明显促进肝癌细胞的增殖;而加入凋亡诱导剂ATRA之后,FCM结果显示细胞凋亡明显增加,加入外源性AFP后,细胞凋亡的情况明显好转,外源性AFP可以增强肝癌细胞的抗凋亡能力。结论外源性AFP不仅可以促进肝癌细胞系的增殖,同时还可以增强肝癌细胞的抗凋亡能力。     

北京市男男性行为人群庚型肝炎病毒感染率和流行亚型分析

本研究仅分析了MSM经性传播GBV-C的情况, 并不包括经血传播的实例;此外对GBV-C变化及其影响HIV/AIDS进程由于观察时间短尚难有定论。这些均是本文的不足。因此对该人群队列的长期观察可进-步揭示GBV-C和HIV感染间的相关性。     

角蛋白18在33和52位丝氨酸磷酸化水平的变化及与肝纤维化的关系

目的 探讨角蛋白18(keratin 18,K18)在33和52位丝氨酸(Ser)磷酸化水平变化的作用及其与肝纤维化的关系.方法 6周龄Balb/C小鼠30只,分为3组(对照组和2个实验组),每组10只.对照组腹腔内注射橄榄油;实验组腹腔内注射四氯化碳(CCl4)和橄榄油的混合液(1:9),10 ml/kg,每周2次,连续4周,分别在2周和4周处死小鼠.应用组织化学免疫荧光法检测正常对照小鼠和肝纤维化小鼠肝组织中K18及其磷酸化Ser33和Ser52的表达及其相对亚细胞定位;免疫印迹法(Western blotting)检测正常对照小鼠和肝纤维化小鼠肝组织的K18及其磷酸化Ser33和Ser52水平.结果 组织化学免疫荧光结果显示,K18在正常对照小鼠和肝纤维化小鼠肝组织中均有表达,但在小鼠肝纤维化不同阶段无明显差异;在正常对照小鼠肝组织中表达比较弱,而随着肝纤维化的进展表达增强.West-ern blotting结果,肝纤维化小鼠肝组织中的Ser33和Ser52磷酸化的K18表达水平显著增加,尤其是Ser33表达增加更为明显.     

Alu-LTR PCR方法检测HAART治疗系列各细胞亚群的整合型HIV-1 DNA

目的应用Alu-LTR PCR方法对高效抗反转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)系列的CD4+T,CD8+T及B细胞进行检测,明确不同细胞亚群及HAART治疗的不同阶段是否存在整合的HIV-1 DNA。方法收集20例HIV-1感染患者HAART治疗过程中0、4、12周及10例健康对照的抗凝血标本,纯化CD4+T,CD8+T及B细胞并提取DNA,应用Alu-LTR PCR方法进行检测。结果 20例HIV-1感染者HAART治疗系列中CD4+T细胞及CD8+T细胞成功扩出目的片段,CD8+T细胞所扩条带亮度均低于CD4+T细胞,HAART治疗系列0、4、12周标本所扩条带亮度没有明显差异。B细胞及10例健康者均为阴性。结论 CD4+T及CD8+T细胞存在整合型HIV-1 DNA,HIV储藏库主要存在于CD4+T细胞内。B细胞内不存在整合型HIV-1 DNA。随着HAART治疗的进程,整合型HIV-1 DNA仍然存在,进一步证明HAART不能根除HIV储藏库。     

癌基因Ras及其常见突变与P53协同作用对结肠癌细胞化疗药物敏感性的研究

目的 探讨P53与Ras及常见Ras突变协同作用对结肠癌细胞化疗药物敏感性的影响.方法 P53-/-的结肠癌细胞(HCT116 P53-/-)中分别单转染Ras野生型、Ras V12、Ras N17质粒,另外3组细胞分别转染以上质粒后感染P53腺病毒.用奥沙利铂处理12 h后分别用钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)染色、实时荧光定量PCR(Real-timePCR)、免疫印迹(WB)检测各组凋亡水平.结果 Calcein-AM/PI染色显示,Ras V12转染组凋亡率[(16.8±1.7)％]显著高于Ras[(8.3±1.5)％,P＜ 0.01]和Ras N17转染组[(4.4±1.6)％,P＜0.01],Ras N17转染组凋亡率最低(P=0.016);P53腺病毒处理3组凋亡率均显著增高,仍以Ras V12转染组凋亡率[(25.9±2.2)％]为最高,Ras N17转染组最低[(7.6±1.2)％].Real-time PCR和WB显示,P53存在与不存在条件下,Ras V12转染组Bax mRNA和蛋白表达均显著高于Ras和Ras N17转染组;Bcl-2水平则与Bax水平相反(P均＜0.05).结论 Ras突变体Ras V12过表达能够引起奥沙利铂作用下细胞凋亡的增加,而突变体RAS N17能够降低细胞凋亡;P53与Ras有协同作用,能够提高Ras的促细胞凋亡作用,提高细胞对奥沙利铂化疗药的敏感性.     

中国健康人趋化性细胞因子CCL3L1的基因拷贝数及其与HIV-1易感性关系的初步研究

目的研究中国健康人群趋化性细胞因子配体蛋白CCL3L1（CC chemokine ligand 3-like-1）的拷贝数及其与HIV易感性的关系。方法收集全血标本,提取基因组DNA,应用Realtime PCR法分析其CCL3L1的相对拷贝数。首先选取22例健康人和23例HIV慢性感染者计算其CCL3L1拷贝数,分析我国健康人群CCL3L1平均拷贝数情况,并分析HIV感染和CCL3L1拷贝数的关系;选取男性同性恋早期感染HIV阳性者29例和HIV阴性者57例,分析CCL3L1基因拷贝数与HIV易感性的关系。结果我国人群CCL3L1平均拷贝数约为3;HIV慢性感染者与健康人无显著性差异（P=0.880）;同性恋HIV阴性者CCL3L1拷贝数显著高于同性恋HIV阳性者（P=0.000）。结论我国健康人CCL3L1平均拷贝数为3,CCL3L1拷贝数与HIV易感性关系密切。     

肿瘤基因治疗的研究进展

基因治疗是指将外源正常基因通过基因转移技术导入靶细胞,纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗目的的一种生物治疗方法。本文从自杀基因、基因沉默、抑癌基因、免疫基因、抑制血管生成基因等几方面综述了近几年肿瘤基因治疗的研究和发展现状。自杀基因治疗系统包括HSV-tkGCV系统、H19 RNA、hTERT等,HSV-tkGCV系统是自杀基因治疗系统研究最多的一种,TK基因是药敏基因,肿瘤细胞转染该基因后,对前体药物丙氧鸟苷(GCV)或无环鸟苷(ACV)变得敏感而能被杀死。RNA干扰是基因沉默治疗的主要方式,通过沉默肿瘤相关基因IDO2、DUSP6、IGF1R、ORAOV1等基因可以明显抑制肿瘤生长。抑癌基因激活或过表达可以抑制肿瘤生长,p53和PTEN是两个最有意义的抑癌基因,重组腺病毒p53和PTEN可以显著抑制肿瘤生长。免疫基因治疗是将细胞因子或共刺激分子基因导入肿瘤细胞或体细胞内,通过激发或调动机体免疫功能来控制或杀伤肿瘤细胞,常用的免疫效应细胞有TIL、CTL、LAK、NK等,可供选择的目的基因有肿瘤坏死因子、白介素、集落刺激因子、干扰素、趋化因子等。抑制血管生成基因可以通过抑制肿瘤新生血管的生成,来阻止肿瘤生长和侵袭,VEGF-Trap、PEDF、ES通过腺病毒导入肿瘤可以显著抑制肿瘤生长。目前肿瘤基因治疗在特异性、安全性和靶向性方面依然存在亟需解决的问题。      

p53凋亡刺激蛋白2基因肝脏条件性敲除小鼠的构建和鉴定*

目的 采用Cre-LoxP系统构建p53凋亡刺激蛋白2(ASPP2)基因肝脏条件性敲除小鼠。 方法 利用自行设计的sgRNA 序列,在ASPP2基因两端插入LoxP序列,构建ASPP2-flox 小鼠。采用PCR法和测序法对F0代和F1代小鼠进行基因型鉴定。将ASPP2-flox F1小鼠与特异性表达Alb-Cre的工具鼠交配,获得肝脏敲除ASPP2基因小鼠。采用PCR法进行基因型鉴定。采用Westernblot和免疫组化法检测ASPP2基因肝脏敲除小鼠肝脏ASPP2蛋白表达。结果 对F0代和F1代动物基因行PCR和测序结果表明,构建ASPP2-flox 小鼠成功;F1代杂合子的基因型为ASPP2 fl/-;将F1代杂合子与Alb-Cre小鼠进行杂交后,回交ASPP2 fl/-小鼠,其基因型为ASPP2fl/fl CreT, 即为ASPP2肝脏条件性敲除小鼠;经Western blot和免疫组化法检测显示ASPP2fl/fl CreT小鼠肝脏ASPP2 蛋白表达显著减少。结论 基于Cre-LoxP系统成功构建ASPP2基因肝脏条件性敲除小鼠,为后续实验作了良好的基础。     

ASPP2在人肝星状细胞活化中的作用

目的 探讨p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis-stimulating protein of p53-2,ASPP2)对人肝星状细胞活化的调节作用及机制.方法 人永生的肝星状细胞系LX-2在孵箱中培养,转染ASPP2腺病毒和单荧光自噬指示体系(GFP-LC3)质粒,免疫印迹法检测ASPP2、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、自噬基因表达相关蛋白(Beclin-1)的表达水平.免疫荧光检测,LX-2细胞共转染ASPP2腺病毒和GFP-LC3质粒后,ASPP2过表达对LX-2细胞自噬的影响,M30染色检测ASPP2过表达对LX-2细胞凋亡的影响.结果 转染ASPP2腺病毒后LX-2细胞内ASPP2蛋白表达明显增加;与转染对照空载腺病毒的LX-2细胞相比,转染ASPP2腺病毒的LX-2细胞自噬和α-SMA的表达明显减少,肝星状细胞的活化受到抑制;转染ASPP2腺病毒后LX-2细胞的凋亡水平增加明显.结论 ASPP2过表达在体外具有抑制肝星状细胞活化的作用.