非布鲁杆菌病流行区7例布鲁杆菌病患者临床分析

目的 研究非布鲁杆菌病流行区布鲁杆菌病患者的流行病学、临床特征,提高非流行区医务工作者对布鲁杆菌病的认识.方法 回顾性分析南京医科大学第一附属医院2011年收治的7例布鲁杆菌病患者的流行病学资料、临床表现、辅助检查、治疗情况.结果 7例患者均有与来自布鲁杆菌病流行地区羊的密切接触史;临床上以非波状热型的中高热、乏力、纳差、体质量下降、关节痛等症状为主,同时呼吸系统症状亦较为突出,多汗、肝脾肿大等多不明显,同时有较为少见的帕金森样震颤等神经系统损害表现;T淋巴细胞及B淋巴细胞比例异常,血培养耗时较长;药敏试验结果显示,布鲁杆菌对甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑、左氧氟沙星、四环素、阿米卡星敏感,而对头孢类抗生素则多有耐药;经左氧氟沙星联合甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑治疗后均痊愈.结论 布鲁杆菌病有从传统流行区向外扩散的趋势;发热待查患者如有羊密切接触史,应考虑布鲁杆菌病的可能,且临床上需注意呼吸系统损伤、帕金森样震颤等非常见的表现;治疗上可选用左氧氟沙星联合甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑.     

乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞应答与不同临床感染状态的关系

目的 分析人类白细胞抗原(HLA)-A0201限制性的特异性CTL,研究急性肝炎急性期和慢性乙型肝炎活动期患者T淋巴细胞对特异性抗原表位免疫应答的差异.方法 收集HLA-A0201阳性的5例急性肝炎急性期和6例慢性乙型肝炎活动期患者的外周血单个核细胞(PBMC),酶联免疫斑点技术(ELISPOT)测定针对HBV聚合酶区(Pol575-583)、包膜区(Env348-357)和核心区(Core18-27)3个CD8+T淋巴细胞表位肽特异性CTL的数量和功能.数据采用t检验.结果 经Pol575-583、Env348-357和Core18-27三条抗原肽刺激,急性乙型肝炎急性期患者组斑点形成细胞数(SFC)分别为110±13、165±17和185±20;慢性乙型肝炎活动期患者组SFC分别为22±4、23±5和30±5,两组差异有统计学意义(t值分别为10.9、15.2和8.0,均P<0.05).急性乙型肝炎急性期患者各抗原肽特异性CTL的应答能力Pol575-5830.05).非特异性HLA-2402限制性Core117-125刺激也出现SFC增加,但与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 急性感染者HBV特异性CTL应答水平显著高于慢性HBV感染者,慢性乙型肝炎患者体内的多克隆CTL数量和功能低下.     

慢性丙型肝炎患者外周血淋巴细胞亚群与病毒载量的相关性分析

目的:分析慢性丙型肝炎患者外周血淋巴细胞亚群的变化以及与HCV病毒载量的相关性,探讨慢性HCV感染慢性化的免疫机理.方法:应用直接免疫荧光-流式细胞术检测47例慢性丙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞的相对数量,与35例正常健康人做比较;应用实时荧光定量RT-PCR对其外周血HCV病毒载量进行检测,将慢性HCV感染者分为两组进行比较分析.结果:外周血CD4 T淋巴细胞比例和CD4/CD8比值慢性丙型肝炎患者组低于正常人组(P＜0.05),HCV RNA阳性组与HCV RNA阴性组之间的差异无统计学意义(P＞0.05);NK细胞比例慢性丙型肝炎患者组高于正常人组(P＜0.05),HCV RNA阴性组高于HCV RNA阳性组(P＜0.05).结论:慢性HCV感染者存在细胞免疫功能低下,NK细胞介导非特异性免疫的持续上调,在有效地清除了部分HCV病毒的同时,可能促进了持续性免疫性肝损伤.     

乙型肝炎e抗原对外周血单核细胞Toll样受体2表达的影响

目的 探讨HBeAg对外周血单核细胞表面Toll样受体2(TLR2)表达的影响.方法 对68例慢性乙型肝炎(CHB)患者(其中HBeAg与HBV DNA刚性37例,HBeAg阴性、HBVDNA阳性14例,HBeAg与HBV DNA阴性17例)和16名健康人的外周血肝素抗凝,加入Pam3CSK4在37℃、5%CO2条件下刺激3 h,用特异性TLR2单克隆抗体标记,经流式细胞仪检测CD14+细胞表面TLR2表达的百分率;比较刺激前后各组之间的差异.定量检测HBV DNA和血清HBV标志物,分析TLR2表达水平与HBeAg、HBV DNA的关系.用HBeAg与健康人及HBeAg阴性CHB患者的抗凝血在37℃、5%CO2条件下共培养6 h,用流式细胞仪定量分析HBeAg刺激后CD14+细胞表面TLR2的表达水平. 结果 HBeAg阳性CHB患者外周血CD14+细胞TLR2的表达率为47.57%±21.40%,明显低于健康对照组(76.51%±7.46%)和HBeAg阴性组(HBV DNA阳性组为73.2%±14.2%、HBV DNA阴性组为75.2%±11.3%,P<0.05);TLR2的表达水平在HBeAg阴性的HBV DNA阳性或阴性CHB患者组与健康对照组的差异无统计学意义.HBeAg阳性CHB患者外周血单核细胞经Pam3CSK4刺激后,TLR2的表达率明显升高,大部分患者TLR2的表达水平能够达到健康人或HBeAg阴性患者未经配体刺激的水平.健康人或HBeAg阴性CHB患者的外周血与HBeAg共孵育6 h后,CD14+细胞表面TLR2表达水平较HBeAg刺激前明显下降(P<0.05).结论 HBeAg阳性的CHB患者外周血CD14+细胞TLR2的表达水平明显低于HBeAg阴性患者和健康人,HBeAg能够抑制CD14+细胞TLR2的表达,提示HBeAg能够引起CHB患者外周血单核细胞表面TLR2表达的下调,这可能是HBV持续感染的重要因素之一;CHB患者HBVDNA水平可能不影响单核细胞表面TLR2的表达;Pam3CSK4可以明显提高HBeAg阳性CHB患者单核细胞表面TLR2的表达水平,TLR2配体有可能成为CHB免疫治疗的一个潜在靶位.     

脂质体介导乙型肝炎病毒核心抗原基因转染人树突状细胞的效率

目的 观察脂质体介导HBcAg基因转染来源于人外周血单个核细胞(PBMC)树突状细胞(DC)的转染效率.方法 用HES离心沉淀法分离人外周血PBMC,经粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)诱导培养DC,培养第5天以阳离子脂质体为载体将报告基因GFP(DNA:脂质体比例为1:3、1:4、1:5、1:6)及HBcAg基因(DNA:脂质体1:5)导入DC,于72h经流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达率,于48、72、96、120h流式细胞仪检测HBcAg的表达率.将基因转染后的DC 与自体淋巴细胞混合培养,检测其细胞内γ干扰素(IFN-γ)、IL-4表达水平.结果 倒置显微镜下观察脂质体转染后DC的的形态无明显变化.报告基因GFP与脂质体比例不同,其转染效率有差异,72h的表达率为37.12%(1:3)、48.55%(1:4)、52.13%(1:5)、50.75%(1:6).HBcAg基因转染DC后48、72、96、120h的HBcAg表达率分别为31.58%、55.80%、54.18%、56.99%.转染后DC与自体淋巴细胞混合培养后,淋巴细胞高表达IFN-γ,较少表达IL-4,呈现Th1为优势的免疫应答.结论 应用阳离子脂质体能有效的将HBcAg基因转染到人PBMC来源的DC,转染72h后抗原表达稳定;转染HBcAg基因的DC仍以诱导Th1免疫应答反应为主.     

健康人单核细胞来源树突状细胞Toll样受体的表达模式分析

目的体外诱导健康人外周血单核细胞来源的树突状细胞（dendritic cell,DC）,动态定量分析DC表达Toll样受体（TLRs）的种类,探讨TLRs的表达水平与DC成熟的相关性。方法用羟乙基淀粉（HES）分离健康人外周血单个核细胞（PB-MC）,经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素4（rhlL4）诱导培养DC,于培养5d加或不加肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素一仅（IFN一仅）,诱导其为成熟与未成熟两种类型的细胞。分别于3、5、7d用特异性单克隆抗体（单抗）标记未成熟DC（immature DC,imDC）和7d成熟DC（mature DC,mDC）,在流式细胞仪（FACS）上检测,用CellQuest软件分析细胞表面共刺激分子（B7—1、B7—2）和MHCII类分子以及细胞内、外TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9的表达百分率。结果健康人TLR3在imDC细胞膜表面的表达高于细胞内,并随着培养时间的延长有所下降;TLR4则主要表达在imDC细胞膜外,并伴随着干预性成熟而下降;TLR7在imDC细胞内的表达高于细胞表面,并随着imDC生长时间延长而逐渐增加,DC成熟时表达下降;TLR8和TLR9细胞内外均有表达,但细胞内稍高于细胞外,随DC成熟而表达增加。结论健康人单核细胞来源的DC表面TLRs的表达具有多样性,TLRs在DC的不同分化阶段表达模式不同,这种差异可能是DC通过TLRs识别病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMPs）的基础,从而有效地调节或控制固有免疫与获得性免疫。     

T淋巴细胞活化在严重发热伴血小板减少综合征疾病发展中的作用

目的 探讨严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSv)感染过程中,外周血T淋巴细胞活化对血液细胞、组织损伤和疾病发展的影响.方法 应用流式细胞术,动态定量监测严重发热伴血小板减少综合征(SFTS)患者外周血中T淋巴细胞表面CD69、HLA-DR、CD28和CTLA-4等表达水平,分析其细胞表面分子变化与血清酶学以及白细胞和血小板异常的关系.结果 SFTS患者T细胞活化分子CD69和HLA-DR在整个病程中表达水平明显增加(P＜0.05);CD4+细胞表面CD28的表达在SFTSV感染早期明显减低,但随病程发展而逐渐回升至正常范围,而T细胞表面CTLA-4的高表达则出现在感染后的中晚期.SFTS患者病程中,血清ALT、AST和LDH、CK等均明显高于正常范围,并伴随着T细胞表面CD69、HLA-DR等活化分子下调和CTLA-4表达水平上调而逐步恢复正常;白细胞和血小板计数的最低值出现在病程初期,伴随着T细胞表面CD69、HLA-DR等活化分子下调和CTLA-4表达增加逐渐回升至正常范围.结论 T淋巴细胞的过度活化可能是组织损伤的主要因素之一,而CTLA-4高表达,则可能是对机体T淋巴细胞过度活化的一种负反馈调节,在SFSTV感染者的免疫应答调节中发挥重要作用.     

输入性疟疾18例临床特点分析

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HBeAg真核表达质粒在293T细胞中表达的研究

目的:观察构建的真核表达质粒pJW4303/HBe在人胚肾细胞(293T)中的表达。方法:将构建好的质粒pJW4303/HBe经脂质体导入293T细胞中,分别在转染后3d、6d、9d及12d收集上清,同时对转染的细胞进行传代和冻存,传代的细胞收集上清,冻存的细胞复苏后收集上清。运用ELISA检测表达量的变化。结果:转染后3d、6d、9d及12d细胞上清液1 8稀释后HBeAg检测的OD值分别为1.047±0.093、1.494±0.112、0.998±0.087、0.678±0.124;不同时间转染传代3d后细胞上清液1 8稀释后HBeAg检测的OD值分别为0.943±0.135、1.378±0.127、0.791±0.145、0.505±0.098,不同时间转染冻存复苏3d后细胞上清液HBeAg检测的OD值分别为0.523±0.113、0.742±0.093、0.41±0.106、0.261±0.089。结论:质粒pJW4303/HBe转染293T细胞6d后HBeAg抗原表达量最高,经传代和冻存复苏后的转染细胞仍然能够表达抗原。