宫颈癌组织中DNA甲基转移酶1、3A和3B mRNA的表达

目的探讨DNA甲基转移酶1、3A和3B在宫颈癌发生发展中的作用。方法应用real-time PCR技术检测10例宫颈癌、10例宫颈上皮内瘤变和10例正常宫颈组织DNMT1、3A和3BmRNA的表达。结果宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT 1mRNA对GAPDH mRNA的相对丰度值分别是0.30±0.1、0.26±0.12和0.10±0.04,宫颈癌组织组织中与正常宫颈中DNMT 1表达有显著差异（P〈0.05）;宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT3A mRNA对GAPDH mRNA的相对丰度值分别是0.94±0.27、0.51±0.24和0.13±0.04,三组相比较有显著性差异（P〈0.05）;宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT 3B mRNA对GAPDH mR-NA的相对丰度值分别是0.30±0.09、0.28±0.11和0.11±0.04,宫颈癌组织组织中与正常宫颈中DNMT 3B表达有显著差异（P〈0.05）。结论 DNMT1、3A和3B参与了宫颈癌的发生,并在宫颈上皮内瘤变时就已经起了一定作用。     

钒化钠对食管癌细胞系EC109 Caspase-3表达的影响

目的：研究钒化钠对食管癌细胞系EC109 Caspase-3激活的影响,探讨钒化钠影响食管癌细胞系EC109细胞生长的机制。方法：以体外培养食管癌细胞系EC109为研究对象,给予0、0．1、1．0、5．0、10．0、50．0、100．0、200．0μmol／L钒化钠,培养1小时后,用Western blot技术检测食管癌细胞系EC109 Caspase-3激活情况。结果：0、0．1、1．0、5．0、10．0μmol／L钒化钠组培养1小时后,各组Caspase-3蛋白激活与对照组比较均无统计学意义;50．0、100．0、200．0μmol／L钒化钠组培养1小时后,各组Caspase-3蛋白表达均升高。结论：高浓度的钒化钠可能激活EC109细胞Caspase-3蛋白。     

稳定表达EGFP-LC3蛋白SH-SY5Y细胞系的构建

目的:建立稳定表达微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)与绿色荧光蛋白(EGFP)形成的融合蛋白(EGFP-LC3)的人神经母细胞瘤株SH-SY5 Y细胞系,验证EGFP-LC3点状聚集物能够实时直观地反映自噬小体和自噬流.方法:以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)的cDNA为模板,克隆LC3,并连接EGFP绿色荧光蛋白.将EGFP-LC3连接入慢病毒载体GV348中,构建慢病毒表达载体EGFP-LC3-GV348.慢病毒转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5 Y细胞),使用3μg/mL嘌呤霉素筛选并处理细胞1月,筛选得到EGFP-LC3稳转系.诱导自噬后,用共聚焦显微镜观察LC3荧光斑点并定量分析.Western blot检测目的蛋白表达情况.结果:经酶切证实,EGFP-LC3-GV348慢病毒表达载体构建正确.在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内的绿色荧光EGFP代表的自噬小体,活体染料LysoTracker Red DND-99将溶酶体染成红色荧光,红色荧光与绿色荧光重叠代表自噬溶酶体.无血清诱导自噬后,自噬小体(绿色荧光斑点)明显增加,差异有统计学意义(P<0.001).Western Blot免疫印迹可见EGFP-LC3融合蛋白表达条带.结论:成功构建了稳定表达EGFP-LC3的SH-SY5 Y细胞系,EGFP-LC3荧光斑点可以直观实时反映自噬囊泡,为进一步探讨神经退行性疾病的自噬机制提供了实验基础.     

低氧预适应对小鼠大脑HIF-α表达的影响

目的 观察重复性低氧对小鼠大脑内HIF-α蛋白质表达的影响.方法 小鼠低氧0次(H0)、1 次(H1)、4 次(H4)后取海马组织,应用免疫组织化学技术,检测小鼠海马组织内HIF-α的蛋白表达变化.结果 实验发现HIF-1α在H0 、H1 、H4 组小鼠海马脑片中阳性表达,H4 组染色明显加深,在大脑皮层和海马锥体细胞层、分子细胞层、齿状回均有较高表达.结论 急性低氧预适应使小鼠大脑内HIF-α表达增加.     

低氧预适应对小鼠海马组织细胞红蛋白表达的影响

目的探讨细胞红蛋白在低氧预适应小鼠海马中的作用。方法复制急性重复低氧模型,利用Real-time PCR法检测小鼠海马组织细胞红蛋白的变化。结果低实验组小鼠海马组织细胞红蛋白mRNA的表达虽然高于未经低氧的对照组但未达到统计学意义,低氧预适应组小鼠海马组织细胞红蛋白mRNA的表达显著高于对照组。结论小鼠急性重复缺氧后脑海马神经元细胞红蛋白mRNA表达增强,推测细胞红蛋白可能参与低氧预适应形成和脑保护。     

5-aza-dC对293A细胞增殖的影响

目的观察5-氮-2’脱氧胞苷(5-aza-2’deoxycytidine,5-aza-dC)对293A细胞增殖的影响,初步探讨其在治疗肾脏肿瘤的作用及可能机制。方法实验组以1.0μmol/L的5-aza-dC处理人胚肾癌293A细胞,对照组加等体积的磷酸缓冲液(PBS),用MTT法测定实验组和对照组1～4 d的光密度值,通过比较实验组和对照组的第4天吸光度值来计算抑制率,流式细胞仪检测5-aza-dC对293A细胞株细胞周期的影响,实时定量PCR检测相关基因DNA甲基转移酶(DNMT)1、3A和3B mRNA的表达。结果 MTT检测实验组和对照组第4天的光密度分别为0.0663±0.0034和0.5453±0.0311,5-aza-dC能抑制人胚肾癌293A细胞的增殖;实验组与对照组相比,实验组91%细胞被阻滞在S期,5-aza-dC处理细胞后使细胞周期发生变化;实验组DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA相对于beta-actin mRNA的丰度值分别是0.036810892±0.007,0.008603032±0.001和0.023717786±0.005,而对照组相对丰度值是0.05594012±0.009,0.0362811±0.011和0.8751847±0.092;5-aza-dC处理使DNMT1、DN-MT3A和DNMT3B mRNA表达降低(P<0.05)。结论 5-aza-dC能抑制293A细胞株的增殖,其作用可能是通过降低DNMTs表达来干扰正常的细胞周期实现的。     

小鼠Reelin 基因启动子克隆鉴定及生物信息学分析

目的克隆小鼠Reelin基因启动子区并分析其潜在DNA甲基化位点和转录因子结合位点。方法根据NCBI上小鼠Reelin 5’非翻译区序列设计引物,利用高保真PCR方法克隆昆明小鼠Reelin启动子区序列,并进行TA克隆,测序鉴定。利用亚硫酸氢钠处理基因组DNA,通过PCR技术和测序技术对Reelin启动子-636 bp至-135bp序列甲基化情况分析。应用Methyl Primer Express software V1.0和TFSEARCH软件分析该区域甲基化位点和转录因子结合位点。结果成功克隆了小鼠Reelin基因启动子区0至-450片段。甲基化测序分析小鼠Reelin启动子区-636 bp至-135 bp序列没有CpG二核苷酸被甲基化。小鼠Reelin翻译起始点0至-450片段利用CpG岛序列分析软件分析显示,该区域C+G含量高达78.71%,CpG含量为14.44%。该区域有120多个潜在转录因子结合位点。结论在小鼠Reelin基因启动子区0～-450发现有一个CpG岛和多个转录因子结合位点,该区域可能在小鼠Reelin基因表达调控起重要作用。     

生物化学教学改革体会

生物化学是在医学类、农学类、理学类院校以不同的生物为对象展开的一门必修基础课程,与各个学科都有着密切的关系,它应用化学的原理和方法研究生命现象及生命物质的组成、结构和生命过程中的各种化学变化。医学类院校中的医学生物化学是通过从生物大分子的结构与功能、物质代谢及调节以及遗传信息的传递和调控机制等方面阐述了生命现象和疾病的本质,这有利于学生掌握生命物质、生命活动和疾病的关系。随着生物化学的不断发展,它涵盖的范围越来越广泛,现已包括了基因工程、蛋白质工程、克隆等高端科技,这些理论和技术已渗透到了基础医学和临床医学各个领域,在探讨疾病的发生、发展以及预防和治疗中有越来越多的应用。     

钒化钠对人食管癌细胞系EC109的增殖抑制作用及机制探讨

目的研究钒化钠对食管癌细胞系EC109的增殖抑制作用,探讨钒化钠对其增殖抑制及cyclin D1表达的影响。方法应用MTT法测定钒化钠对食管癌细胞系EC109细胞株的生长抑制作用。用Western blot的方法检测钒化钠对细胞周期蛋白cyclin D1表达的影响。结果一定浓度的钒化钠对食管癌细胞系EC109有生长抑制作用。实验结果表明,与细胞增殖周期密切相关的cyclin D1蛋白表达降低。结论一定浓度的钒化钠能明显抑制食管癌细胞系EC109细胞株的生长,钒化钠的抗肿瘤机制可能与cyclin D1蛋白表达降低有关。