甲型流感病毒FM1非结构蛋白(NS1)在大肠杆菌表达及其ELISA检测方法建立

目的:构建流感病毒FM1非结构蛋白NS1全长基因表达载体在大肠杆菌(E.coli)中表达,并将表达蛋白用于病毒感染和疫苗免疫小鼠的血清检测.方法:提取流感病毒鸡胚尿囊液RNA,RT-PCR扩增NS1全长基因,克隆到pET28a,转化E.coliBL21感受态细胞,经酶切鉴定及序列分析,筛选出阳性重组质粒pET28-NS1.异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,表达蛋白在变性条件下经镍柱亲和层析纯化,并用Western blot法检测其抗原活性.以纯化的NS1蛋白为抗原建立了检测NS1抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法分别对7、15和30天灭活疫苗免疫和病毒感染小鼠血清进行检测.统计分析各组吸光度(A)差异,并以灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等指标对NS1-ELISA进行方法学评价.结果:重组质粒经PCR及酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确.SDS-PAGE和Western blot结果显示表达重组蛋白分子质量约为26 ku.NS1-ELISA法在第15～30天,感染组血清吸光度明显高于疫苗免疫组.结论:成功获得了NSl重组基因表达蛋白,建立的NS1-ELISA法可用于病毒感染和疫苗免疫血清的鉴别检测.     

定量检测EB病毒VCA-IgA和EA-IgA抗体对EB病毒相关鼻咽癌的诊断意义

目的:评价EB病毒特异性VCA-IgA和EA-IgA抗体定量检测对EB病毒相关的鼻咽癌的诊断意义?方法:试验组为228例鼻咽癌血清标本,对照组为102例正常健康体检者血清标本?用ELISA法定量检测血清标本中EBV特异性VCA-IgA和EA-IgA抗体水平,以临床病理诊断为金标准,分析各血清检测指标的准确性?灵敏性?特异性及其cut-off值的设定?结果:正常健康人血清中EB病毒特异性VCA-IgA和EA-IgA抗体的平均水平分别为15 U/ml 和 11.5 U/ml,鼻咽癌患者血清中VCA-IgA和EA-IgA抗体的平均水平分别为56.5 U/ml 和 63.5 U/ml,鼻咽癌组抗体水平显著高于健康体检组?根据VCA-IgA?EA-IgA定量检测结果绘制ROC曲线图,曲线下面积分别为0.903 和 0.948,VCA-IgA?EA-IgA定量检测可用于鼻咽癌的准确诊断?根据ROC曲线图分析,cut-off值分别设定为30 U/ml 和23 U/ml?按此值设定时,VCA-IgA检测鼻咽癌的敏感性和特异性分别为84.9%和66.8%,EA-IgA检测鼻咽癌的敏感性和特异性分别为87.9%和91.1%?联合检测VCA-IgA和EA-IgA的敏感性为92%,特异性为91%?结论:以ELISA法定量检测VCA-IgA?EA-IgA的血清抗体水平对鼻咽癌具有诊断意义,尤其将两指标联合应用?     

抗人类疱疹病毒６型南京分离株Ｅ５单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备并鉴定人疱疹病毒6型(HHV-6)单克隆抗体.方法:用纯化的HHV,6南京分离株E5免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/O融合,经间接ELISA法筛选,间接免疫荧光法、免疫印迹实验等方法鉴定单抗.并采用套式PCR法和ELISA法,在口腔癌中进行了初步的应用.结果:获得了一株分泌抗HHV-6单克隆抗体的杂交瘤细胞系,命名为JA9.单克隆抗体亚类鉴定表明:其为IgGl亚类,轻链为K.用间接ELISA法检测细胞上清单抗效价为1:500;单抗腹水滴度为1:8.0×104.免疫印迹实验结果表明:JA9单抗腹水与约75 ku HHV-6 E5病毒蛋白结合.口腔癌患者唾液的HHV-6阳性检测率结果分别是:套式PCR法60%.ELISA法40%.结论:成功制备并鉴定一株抗HHV-6南京分离株E5单克隆抗体,为HHV-6进一步的基础研究及临床快速诊断提供可能.     

口腔鳞状细胞癌与人类疱疹病毒6型感染的相关性研究

目的:研究人类疱疹病毒6型(HHV-6)感染与口腔鳞癌的相关性?方法:用PCR和间接免疫荧光方法分别检测口腔鳞癌患者和健康志愿者唾液HHV-6 DNA和血清抗HHV-6 IgG抗体?免疫组化法检测口腔鳞癌组织及癌旁组织标本中HHV-6糖蛋白B(glycoprotein B,gB)抗原?结果:118份口腔鳞癌唾液标本中PCR阳性率为65.3%,高于正常人群的40%(P < 0.05)?HHV-6感染与患者病历资料无显著相关性?18份口腔鳞癌患者和20份健康人血清中HHV-6 IgG抗体的几何平均滴度分别为1∶102.17和1∶101.50(P < 0.05)?免疫组化法检测,11例口腔鳞癌标本中6例出现的阳性结果,胞质内出现弥散性的黄色颗粒,在癌巢内特异性浓集,而间质为阴性?8例相应癌旁组织中3例出现阳性染色结果,但阳性强度较癌组织弱且弥散?1例gB组化阳性肿瘤组织细胞经分离后接种裸鼠,移植瘤组织也检测到HHV-6抗原?结论:本研究说明HHV-6与口腔鳞癌的发生存在相关性,但不与患者临床资料分布相关?本研究亦提示荷瘤裸鼠作为HHV-6动物模型的可能性?