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1.
弱化抗性标记筛选高表达CHO细胞株的方法建立   总被引:1,自引:1,他引:0  
为了优化中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达体系,建立高表达CHO细胞株筛选方法,将外源基因表达载体上抗性筛选基因表达的新霉素磷酸转移酶(NPT)的261位氨基酸天冬氨酸突变成甘氨酸。经G418筛选,转染含突变型NPT表达载体的细胞存活率显著低于转染含野生型NPT表达载体的细胞存活率。以绿色荧光蛋白-抗体IgG1 Fc结构域融合蛋白为报告基因,验证了突变后新霉素磷酸转移酶对抗生素G418抗性减弱。经G418持续加压培养3周后,转染含突变型NPT表达载体的细胞中EGFP的表达量显著高于转染含野生型NPT表达载体的细胞,表明其具有筛选出高表达单克隆细胞株的潜力。  相似文献
2.
优化定点引入对叠氮苯丙氨酸的詹氏甲烷球菌属正交酪氨酰tRNA合成酶/tRNA系统,使用优化后的正交系统在大肠杆菌内表达并纯化在特定氨基酸位点引入对叠氮苯丙氨酸的人内皮抑素突变体。首先将正交酪氨酰tRNA合成酶启动子-15区的TATAA序列突变为TTAA序列,同时将正交酪氨酰tRNA合成酶的第286位天冬氨酸突变为精氨酸以提高对抑制型tRNA反密码子CUA的识别力。然后将质粒pST和pET32a-mhEn转化到大肠杆菌DH10BDE3中得到重组工程菌。该重组菌在含有对叠氮苯丙氨酸的培养基中培养,并经IPTG诱导表达人内皮抑素突变体。利用镍亲和色谱纯化获得人内皮抑素突变体,纯度大于90%。通过对正交酪氨酰tRNA合成酶/tRNA系统的优化,有效提高了系统引入对叠氮苯丙氨酸的效率,人内皮抑素突变体的表达量有了显著提高。  相似文献
3.
以溶菌酶为模型蛋白,通过活性测定比较了PEG修饰前后溶菌酶复性动力学的差异,同时利用圆二色谱、色氨酸荧光谱等方法比较了PEG修饰前后蛋白质折叠过程中构象变化。结果显示:PEG修饰改变了溶菌酶复性动力学过程,使溶菌酶在低浓度变性剂条件下快速折叠。色氨酸荧光谱结果显示,PEG修饰对溶菌酶折叠过程中疏水微环境的形成有明显影响,稳定了溶菌酶折叠过程中的"熔球态",从而提高了溶菌酶正确折叠的概率。  相似文献
4.
以对硝基-L-苯丙氨酸为原料,通过5步反应制备纯度较高的对叠氮-L-苯丙氨酸盐酸盐。利用构建好的重组表达载体和正交氨酰tRNA合成酶/tRNA(MjTyrRS/tRNA)系统将对叠氮-L-苯丙氨酸(pAzPhe)定点(31位)引入到人内皮抑素分子中,表达人内皮抑素中突变体——rhEs31m。对分离纯化所获得的目的产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定,突变体rhEs31m电泳纯度达90%以上,同时可被抗人内皮抑素抗体特异性识别。通过MTT法检测rhEs31m体外抗人脐静脉内皮细胞增殖活性,结果显示:与野生型rhEs相比,rhEs31m保留了大部分生物活性。本实验表明单个pAzPhe的定点引入并未破坏重组人内皮抑素的空间结构和生物活性。  相似文献
5.
将人血清白蛋白第3结构域(3DHSA)与粒细胞集落刺激因子突变体(Nartograstim)融合基因克隆至载体pPICzαA,置于醇氧化酶启动子(AOX)和α交配因子信号肽作用下构建分泌表达质粒,电击转化入毕赤酵母GS115。SDS-PAGE结果显示3DHSA-Nartograstim相对分子质量约为42 kD,Western blot证实其同时具有HSA和G-CSF的抗原性。建立融合蛋白表达的条件为:BMMY培养基pH 6.0、1.5%甲醇、诱导84 h,灰度扫描发现该条件下融合蛋白的纯度为79%。依次采用亲和色谱和疏水色谱纯化得到纯度高于90%的融合蛋白,终产量为86 mg/L。采用MTT法检测融合蛋白对NFS-60细胞株的促增殖能力,结果显示,3DHSA-Nartograstim具有剂量依赖性促进NFS-60细胞增殖的作用。本研究为3DHSA-Nartograstim的进一步研究奠定了基础。  相似文献
6.
慢性非传染性疾病已成为全球致死和致残的首要原因。治疗性B细胞疫苗可以针对疾病中重要的调节因子产生中和性抗体,为慢性病的治疗提供了新思路,目前已在慢性病的治疗上取得了一系列进展。本文就治疗性B细胞疫苗在高血压、自身免疫性疾病及老年痴呆症治疗上的开发和临床试验进展作一综述。  相似文献
7.
为筛选获得对大肠杆菌氨酰合成酶具有高度正交性的琥珀抑制tRNA,建立了一种基于可诱导高拷贝质粒的筛选系统。利用乳糖操纵子对oriL复制子进行调控,有IPTG存在时使其携带的琥珀抑制性tRNA大量转录。正交性不高的琥珀抑制性tRNA大量转录时导致宿主菌死亡,只有携带高正交性的琥珀抑制性tRNA的克隆可以存活,从而达到筛选目的。利用这一筛选质粒,构建了琥珀抑制性tRNA突变文库,并进行了筛选,获得了与大肠杆菌氨酰tRNA合成酶具有高度正交性的突变体,并利用含琥珀抑制突变的半乳糖苷酶突变体进行了验证,证实利用可诱导高拷贝的筛选质粒可筛选出高正交性的琥珀抑制性tRNA突变体。  相似文献
8.
近年来,随着锌指核酸酶、转录激活子样效应因子核酸酶和成簇可调控间隔短回文重复RNA引导核酸酶的出现,“基因组编辑”技术得到广泛应用。由于此类技术具有高效和可定制的特点,在基因治疗、细胞模型、糖基化工程、细胞工程等方面许多新策略、新方法不断涌现,产生了十分重要的影响。本文就近年来基因组编辑技术的发展及其在基因治疗和生物制药领域的应用进行综述。  相似文献
9.
基于荧光素酶报告基因法和本实验室前期构建的CHO-GLP-1R-CRE-Luc+检测模型细胞株,建立并优化了长效降糖多肽——聚乙二醇化Exendin-4类似物PE与GLP-1受体的亲和力测定方法,并对其进行了方法学验证。结果表明,当药物作用4 h,化学发光底物作用15 min,检测药物在5.7×10-3~1.5×103 nmol/L浓度区间内时,该检测方法的专属性和耐用性良好、准确度和精密度较高,符合《生物制品质量控制分析方法验证技术一般原则》的相关要求。本研究为该类GLP-1受体激动剂药物的快速评价与筛选奠定了基础。  相似文献
10.
考察含对硝基苯丙氨酸的B淋巴细胞刺激因子(BAFF)治疗BAFF过表达的自身免疫性疾病的效果。利用本研究前期构建的工程菌,表达纯化了B淋巴细胞刺激因子的可溶型突变体(smBAFF)以及在其65位定点引入了对硝基苯丙氨酸的改构体(pNO2Phe65smBAFF)。通过考察pNO2Phe65smBAFF体外促小鼠淋巴细胞增殖活性、免疫原性以及所诱导的抗血清对天然BAFF活性的抑制作用,评价了其用于治疗BAFF过表达的自身免疫性疾病的可行性;同时采用了cGVHD(graft-versus-host disease)诱导的狼疮肾炎小鼠模型评价了pNO2Phe65smBAFF的药理活性。结果表明:定点引入了对硝基苯丙氨酸的pNO2Phe65smBAFF不具有促进小鼠淋巴细胞增殖的能力;由于对硝基苯丙氨酸的引入显著增强了蛋白的免疫原性,诱导机体产生了可以抑制天然BAFF活性的交叉抗体;在cGVHD诱导的狼疮肾炎小鼠模型中,pNO2Phe65smBAFF可显著减轻疾病症状。定点引入了对硝基苯丙氨酸的pNO2Phe65smBAFF可以作为治疗BAFF过表达的自身免疫性疾病的候选分子。  相似文献
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