p53凋亡刺激蛋白2基因肝脏条件性敲除小鼠的构建和鉴定*

目的 采用Cre-LoxP系统构建p53凋亡刺激蛋白2(ASPP2)基因肝脏条件性敲除小鼠。 方法 利用自行设计的sgRNA 序列,在ASPP2基因两端插入LoxP序列,构建ASPP2-flox 小鼠。采用PCR法和测序法对F0代和F1代小鼠进行基因型鉴定。将ASPP2-flox F1小鼠与特异性表达Alb-Cre的工具鼠交配,获得肝脏敲除ASPP2基因小鼠。采用PCR法进行基因型鉴定。采用Westernblot和免疫组化法检测ASPP2基因肝脏敲除小鼠肝脏ASPP2蛋白表达。结果 对F0代和F1代动物基因行PCR和测序结果表明,构建ASPP2-flox 小鼠成功;F1代杂合子的基因型为ASPP2 fl/-;将F1代杂合子与Alb-Cre小鼠进行杂交后,回交ASPP2 fl/-小鼠,其基因型为ASPP2fl/fl CreT, 即为ASPP2肝脏条件性敲除小鼠;经Western blot和免疫组化法检测显示ASPP2fl/fl CreT小鼠肝脏ASPP2 蛋白表达显著减少。结论 基于Cre-LoxP系统成功构建ASPP2基因肝脏条件性敲除小鼠,为后续实验作了良好的基础。     

黄芪超微粉对环磷酰胺致免疫失衡小鼠免疫功能的影响

目的:观察黄芪超微粉对环磷酰胺免疫失衡小鼠免疫功能的影响.方法:将5～6周龄昆明种小鼠60只随机分为对照组、模型组、黄芪饮片组(HQY,10 g/kg)、黄芪超微粉高剂量组(HQFH,10 g/kg)、黄芪超微粉中剂量组(HQFM,2g/kg)、黄芪超微粉低剂量组(HQFL,0.4g/kg),每组10只,雌雄各半.模型...     

靶向RelA(p65)基因shRNA慢病毒载体构建及功能鉴定

［摘要］　目的　构建靶向RelA（p65）基因的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）慢病毒载体，并对其功能进行验证。方法　设计3对针对RelA基因的RNA干扰序列，并合成相应的shRNA序列。shRNA退火形成双链oligo序列后应用基因重组技术构建重组质粒，经菌落聚合酶链式反应（PCR）及测序鉴定，将重组正确的质粒进行慢病毒包装和滴度测定，通过Western blot实验筛选出对HepG2细胞株中RelA基因干扰效果最好的慢病毒，并通过CCK-8检测Lenti-shRelA对细胞增殖活性的影响。结果　测序结果显示重组慢病毒载体与设计参考序列一致，提示重组慢病毒载体构建成功。重组慢病毒Y4056、Y21318、Y21319、Y21320的滴度分别为3.13×10⁸ TU/ml、2.97×10⁸ TU/ml、2.51×10⁸ TU/ml、3.40×10⁸ TU/ml。用慢病毒Lenti-shRelA（Y21318、Y21319、Y21320、Y4056）感染HepG2细胞，Western blot实验结果显示Y21320对HepG2细胞株中RelA基因的干扰效果最好。CCK-8实验结果显示RelA的敲降可显著抑制细胞增殖活力。结论　该研究成功构建了靶向RelA基因shRNA慢病毒载体，其能有效下调HepG2细胞RelA的表达并抑制细胞增殖，为进一步研究RelA在肝癌发生、发展中的机制奠定了基础。