乳酸脱氢酶与蚊虫对溴氰菊酯抗性相关性的研究

目的研究乳酸脱氢酶(LDH)与蚊溴氰菊酯抗性之间的关系。方法应用RT-PCR及cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end,RACE)技术扩增白纹伊蚊LDH全长基因;用实时荧光定量PCR检测敏感和抗性蚊C6/36细胞中LDH基因的表达水平;用乳酸脱氢酶活性检测试剂盒检测敏感和抗性蚊细胞中LDH酶活性。结果 LDH基因全长共1831 bp,其中ORF为996 bp,共编码331个氨基酸。该基因与埃及伊蚊、黑腹果蝇、小家鼠和人的乳酸脱氢酶的同源性分别为89%、72%、66%和65%。实时荧光定量PCR结果表明,LDH基因在抗性蚊细胞中高表达,为敏感蚊细胞的1.87倍(P<0.05)。LDH酶活性检测结果显示,LDH在敏感蚊细胞中的酶活性范围为1～95 U/gprot,均值为40 U/gprot;在抗性蚊细胞中的酶活性范围为20～150 U/gprot,均值为75 U/gprot(n=15,P<0.01)。结论抗性蚊细胞中的LDH表达量和酶活性均高于敏感蚊细胞,提示LDH可能与蚊溴氰菊酯抗性相关。     

淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4家族新成员基因克隆及序列分析

目的　获取淡色库蚊CYP4家族新基因。　方法　根据CYP4氨基酸保守序列设计一对简并引物 ,采用RT PCR的方法 ,从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系四龄幼虫总RNA中扩增出与设计相符的基因片段。利用T/A克隆方法 ,将获得的基因片段克隆入 pGEM Teasy载体 ,经PCR鉴定重组成功 ,测序并进行比对。　 结果　共克隆出 3 6个阳性克隆 ,将其中 9个随机挑取的阳性克隆测序及同源性分析 ,表明为CYP4家族中 9个新的cDNA序列 ,由GeneBank登录上网 ;经国际细胞色素P45 0命名委员会鉴定 ,属CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。为进一步研究细胞色素P45 0的多样性及其与抗药性的关系打下基础。　结论　克隆 9个淡色库蚊基因部分序列 ,被鉴定属于CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。     

对溴氰菊酯抗性和敏感淡色库蚊不同发育阶段的抗生水平

对室内选育的淡色库蚊用浸渍法测定了Ⅱ龄，Ⅲ龄和Ⅳ龄和幼虫，用接触筒法了早期，中期和晚期成虫。并观察了增效醚，磷酸三苯酯和杀虫脒与溴氰菊酯混用后的增效效果。结果表明：１．淡色库蚊各发育阶段对溴氰菊酯的抗性水平，在敏感品系由高至低依次为中期，晚期，早期成虫，Ⅳ龄，Ⅲ龄和Ⅱ龄幼龄，在抗性品系为早期，中期，晚期成虫，Ⅳ龄，Ⅲ龄和Ⅱ龄幼。２．ＰＢ和杀虫脒均有明显增效作用，提示抗性可能与氧化代谢增强和靶标部位     

用0.1mm超薄凝胶做等电聚焦电泳

等电聚焦电泳是一种有高分辨率的分析技术。用1mm厚度的聚丙烯酰胺凝胶做支持物,通常每一加样片的加样量为15μl,根据染色敏感性,蛋白浓度一般为1～15mg/ml。用考马斯亮蓝染色的最适蛋白量是每一轨道20μg。低于此量难以得到理想结果。在实际应用中有时会遇到蛋白浓度较     

用抑制性差减杂交法和基因芯片鉴定蚊虫抗药性和敏感性相关基因

由于杀虫剂的广泛、大量和长期使用 ,媒介昆虫对杀虫剂逐步产生了抗药性 (抗性 )。对媒介昆虫抗性的分子机理研究具有重要的理论意义和潜在的应用价值。抗药性和 (或 )敏感性相关基因的分离将为抗性分子机理的深入研究打下基础。近年来 ,国外研究者采用经典的“功能克隆法”克隆到一些抗药性相关基因。然而 ,在事先无目的蛋白或其相应基因定位的情况下分离这些基因是相当困难的。最近建立的抑制性差减杂交法 ( suppression subtractive hybridization,SSH )这一“表型克隆”新策略 ,无需事先知道起作用基因的背景资料 ,仅凭表型直接分离基…     

将科研融入人体寄生虫学教学的探讨

针对目前人体寄生虫学教学中存在的问题和不足,结合当前教学改革的理念和意义,将科研融入人体寄生虫学教学。从教学内容、教学手段和方法等方面总结和分析了近几年来实施该教学改革的一些心得体会,以期为更好开展人体寄生虫学教学提供借鉴和参考。     

杀虫剂的酶促降解及其研究进展

杀虫剂被广泛使用以来,对生态环境的污染、食物中的农药残留等问题引起人们日益关注,研究杀虫剂的酶促降解将为解决杀虫剂污染及残留提供新的途径,本文对常见几类杀虫剂的酶促降解及其研究进展予以综述。     

沃尔巴克氏体与淡色库蚊溴氰菊酯抗性关系初步研究

目的 目的 探讨沃尔巴克氏体与淡色库蚊溴氰菊酯抗性间的相关性。 方法 方法 以PCR鉴定本实验室饲养的淡色库 蚊体内的沃尔巴克氏体, 采用实时定量PCR技术 （qRT?PCR） 测定并比较淡色库蚊溴氰菊酯抗性和敏感品系中沃尔巴克 氏体表达差异。 结果 结果 本实验室饲养的淡色库蚊体内含有沃尔巴克氏体。淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系卵、 一龄蚊、 二 龄蚊、 三龄蚊、 四龄蚊、 雌蚊、 雄蚊体内沃尔巴克氏体表达水平分别是敏感品系的18.42、 3.69、 4.43、 3.96、 6.31、 1.55、 3.76 倍, 差异均有统计学意义 （P均< 0.05）, 而抗性品系和敏感品系蛹中沃尔巴克氏体表达水平差异无统计学意义 （P > 0.05）。南京江心洲溴氰菊酯抗性雌蚊体内沃尔巴克氏体表达水平是敏感雌蚊的2.64倍。 结论 结论 沃尔巴克氏体可能与 淡色库蚊对溴氰菊酯产生抗性有关。     

淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4E2r6基因的克隆与生物信息学分析

目的 从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫扩增并分析CYP4E2r6基因，为蚊虫抗药性的研究、检测和防治筛选靶标。方法 根据已扩增的CYP4E2r6基因片段（长470bp，GenBank登录号为CB074945）的序列设计2条特异引物，从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫提取RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，用5’-RACE和3＇-RACE方法，各获得722bp、617bp片段。进行序列拼接并对所得新基因进行登录和生物信息学分析。结果获得了1条3’端含polyA尾，长1025bp的CYP4E2r6基因大片段（GenBank登录号为AY309972），编码289个氨基酸，与果蝇细胞色素P450氨基酸的同源性为55％。编码蛋白的理论分子质量单位为32．9ku，等电点为5．8。结论 获得了CYP4E2r6基因大片段，为进一步获取全长基因并研究该基因的功能奠定了基础。     

蚊抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定

目的 建立抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系。方法 采用PCR方法，以淡色库蚊抗药性品系CD-NA文库为模板，扩增出抗药性品系高表达的糜蛋白酶基因编码区；经T／A克隆测序鉴定后，亚克隆到真核表达载体piEl-3，构建重组昆虫细胞表达载体piEl-3／chy，经酶切和PCR鉴定后，与带有筛选标记的piEl-neo质粒共转染蚊细胞C6／36，通过G418选择培养，建立转染细胞系；用RT-PCR、Westernblotting鉴定糜蛋白酶基因的转录表达。结果 成功构建了真核表达载体piE1-3／chy，证明糜蛋白酶基因已转入C6／36细胞，建立了稳定转染细胞系，表达产物分子质量单位约30ku，与理论值相符。结论 稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究糜蛋白酶基因与抗药性的关系奠定了基础。