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目的:利用AdEasy腺病毒载体系统构建含HIV-1病毒蛋白R(viral protein R,Vpr)基因的重组腺病毒,使之有效感染靶细胞前列腺癌细胞系PC-3,并在其中表达Vpr。方法:自表达载体pCI—neo—Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack—Vpr,经限制性内切酶Pme I酶切线性化后,利用磷酸钙介导法将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转化到BJ5183大肠埃希菌。挑选同源重组质粒,经Pac I酶切后回收大片段,并将其转染包装细胞AD293。利用荧光显微镜观察AD293细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达。收集第一代重组病毒上清,使之感染AD293细胞得到第二代病毒,如此反复感染AD293细胞3—4轮,使病毒大量扩增。梯度稀释法测定病毒滴度后,分别以感染复数(MOI)为1、5、10的病毒量感染靶细胞PC-3,荧光显微镜观察细胞中GFP表达,并利用RT+PCR和蛋白质印迹技术分别从mRNA和蛋白水平检测目的基因的转录与表达情况。结果:经限制性内切酶检测、GFP表达和病毒上清液PCR证实成功构建了携带Vpr基因的重组腺病毒,滴度为3.0×10^8efu/ml。以MOI为5的重组腺病毒感染24h后,80%以上的靶细胞能够表达GFP,RT—PCR和蛋白质印迹能够同时检测到目的基因Vpr的转录与表达。结论:成功构建含Vpr基因重组腺病毒,并且病毒能够有效感染PC-3细胞,使得目的基因在其中获得大量表达,为进一步研究Vpr蛋白对PC-3肿瘤细胞的影响及其可能涉及的信号通路奠定了基础。 相似文献
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目的:研究卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是否能够感染前列腺非致瘤性上皮细胞系RWPE-1及前列腺癌细胞系PC-3,并初步探索其相关信号通路变化。方法:将12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)刺激人原发性渗出性淋巴瘤细胞系BC-3,收集细胞上清(含KSHV病毒颗粒),感染RWPE-1及PC-3,观察前列腺细胞的细胞病变效应(CPE)。采用RT-PCR检测KSHV即刻基因ORF50 mRNA转录状况;进一步运用Western blot检查病毒裂解期产物病毒白细胞介素6(vIL-6)的蛋白表达水平;最后采用Western blot法检测被感染细胞胞浆和胞核中β-catenin表达水平。结果:PC-3细胞感染KSHV后未见明显CPE,但RT-PCR和Western blot均在预期位置检测到KSHV基因ORF50和vIL-6的mRNA及其编码的蛋白条带。RWPE-1细胞感染KSHV后可出现明显的CPE,感染后24h可以检测到vIL-6的表达。Wnt通路蛋白β-catenin在感染KSHV的RWPE-1细胞胞浆和胞核均呈上升趋势。结论:KSHV可以感染前列腺细胞系并有可能激活Wnt通路。 相似文献
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目的:优化贴壁法原代培养人皮肤成纤维细胞的条件,建立稳定?经济?高效可行的人皮肤成纤维细胞培养方法?方法:采用包皮环切术后皮肤组织,剪成均匀组织块后贴壁,皮肤边缘长出薄层致密细胞团后胰酶消化?传代,并对所培养的细胞进行形态学观察及细胞免疫荧光鉴定?此方法与酶消化法相对照?结果:优化贴壁法成功率100%,取得组织后2 d沿皮肤边缘均开始生长高密度类圆形细胞层,在1周内可获得高质量?高数量的细胞,传代贴壁后经镜下形态观察及细胞免疫荧光染色确定为皮肤成纤维细胞?结论:较之酶消化法,优化贴壁法细胞存活率高,活性及纯度好?该方法可稳定?经济地获得足够数量的细胞? 相似文献
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目的:探究冠状动脉粥样硬化心脏病患者心外膜脂肪体积(epicardial adipose tissue volume,EATV)、管周脂肪厚度 (perivascular adipose tissue thickness,PATT)与冠状动脉血管病变严重程度的相关性,评估EATV联合临床相关指标预测患者预后的效能。方法:选取南京医科大学第一附属医院81例进行冠状动脉CTA(coronary CT angiography,CCTA)及冠状动脉造影 (coronary angiography,CAG)的冠心病患者,统计所有患者基础基线资料及临床处理方式,基于医院影像系统统计 EATV、 PATT、SYNTAX评分,随访患者出院后6个月内不良心血管事件,包括心血管相关性死亡、心肌梗死、支架再植入、心血管相关疾病再入院、稳定型心绞痛及不稳定性心绞痛发作情况。通过线性回归模型和多元Logistic回归模型分析描述EATV对CCTA 疑诊冠心病患者进一步进行CAG的辅助意义及EATV和PATT与SYNTAX评分的相关性,构建基于EATV和相关临床指标预测冠心病患者预后的模型。结果:①EATV可提高CCTA疑诊冠心病患者进行CAG检查的阳性处理价值(AUC=0.562上升至 AUC=0.771);②Pearson相关统计示:该入组冠心病患者EATV与SYNTAX评分呈正相关(r=0.828,P<0.001),EATV及经身体质量指数(body mass index,BMI)标化的 normalized EATV均与患者的SYNTAX评分成正相关(r=0.774,P<0.001);③ EATV联合临床指标:性别、前降支冠状动脉管周脂肪HU数值(LADHU)、左室舒张期横径(LVDd)(AUC=0.775)较SYNTAX评分(AUC= 0.707)可更准确预测冠心病患者出院后心血管事件的发生。结论:EATV与CAD密切相关,对CCTA拟诊冠心病患者的临床决策具有指导意义。它与SYNTAX评分呈正相关,对冠心病的预后评估具有预测价值。 相似文献
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目的探讨单中心心血管内科门诊流出道室性早搏(OT-PVC)检出率,分析其基本特征。方法对在2013年1月1日至2013年6月30日期间就诊于本中心心血管内科门诊患者的心电图进行检测,并就其中OT-PVC患者情况及其心电图资料进行分析。结果共接诊患者5 545例,检出OT-PVC 160例,占2.89%,其中男性62例(38.75%),女性98例(61.25%)。(50~60)岁年龄段患者38例,占3.53%,高于其他年龄段。71例OT-PVC患者(44.38%)合并其他类型的心电图异常,依次为T波倒置、ST压低、心房颤动、左房负荷异常及房性早搏。分析发现这71例患者与未合并上述心电图异常的89例OT-PVC患者相比平均年龄偏大[(62.2±12.0)岁vs(46.4±16.3)岁,P0.05]。结论单中心心血管病门诊就诊人群心电图OT-PVC检出率为2.89%,其中(≥50~60)岁人群的OT-PVC检出率高于其他年龄段。随着年龄的增长,OT-PVC患者更易合并其他类型的心电图异常。 相似文献
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目的 探讨40岁以下急性心肌梗死(AMI)患者的发病时间特征及其住院期间的预后.方法 AMI患者218例中,年龄≤40岁106例(A组),年龄60-75岁112例(B组).回顾性分析临床资料,比较两组发病的日时间分布及院内预后.结果 A组发病高峰时间是上午6:00-11:59(占38.6%),其次是0:00-5:59(占22.8%);B组发病高峰时间是0:00-5:59(占32.2%),其次是上午6:00-11:59(占30.0%).A组院内死亡率低于B组(5.7%vs.18.8%)(P<0.01).结论 与60-75岁的老年患者比较,40岁以下的AMI患者上午发病者较多,院内预后较好. 相似文献
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