小RNA 2’⁃O⁃甲基转移酶Henmt1在小鼠精子发生中的作用

目的：通过构建基因突变小鼠模型,研究小RNA 2’?O?甲基转移酶Henmt1在小鼠精子发生中的作用。方法：利用CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR?associated protein 9）技术,构建Henmt1基因突变小鼠,通过计算机辅助精子分析、HE染色及免疫荧光检测等技术对小鼠表型进行分析。结果：成功构建Henmt1基因突变小鼠模型;生育力测试结果提示Henmt1基因突变雄鼠不育;Henmt1基因突变导致雄性小鼠精子发生阻滞;突变小鼠睾丸中逆转座子元件LINE1表达上调。结论：Henmt1对雄性小鼠精子发生有重要调控作用。     

m6A识别蛋白Ythdf3在精子发生中的作用研究

目的：通过基因敲除模型研究N6?甲基腺嘌呤（m6A）识别蛋白Ythdf3在小鼠精子发生过程的调控作用。方法：利用CRISPR/Cas9技术构建Ythdf3基因敲除小鼠,通过免疫荧光和HE染色对敲除小鼠进行表型分析,研究Ythdf3在调控小鼠精子发生过程中的作用。结果：免疫组化染色显示Ythdf3在精原及各级生精细胞核中均有表达;成功构建Ythdf3基因敲除小鼠模型;HE染色显示Ythdf3敲除小鼠睾丸各级生精时相及附睾尾精子与对照相比无明显异常。结论：在正常生理条件下,敲除Ythdf3不影响雄性小鼠精子发生。     

应用CRISPR/Cas9和Cas9⁃D10A建立Nsun5基因敲除小鼠模型并分析脱靶效应

目的：为了检测CRISPR/Cas9系统的潜在脱靶效应,分别利用野生型Cas9和切口酶Cas9?D10A构建了RNA甲基转移酶Nsun5基因敲除小鼠模型,并对两种策略得到的F0小鼠进行脱靶分析,以比较两种敲除策略的特异性。方法：针对Nsun5基因第3外显子,设计1对sgRNA,将野生型Cas9 mRNA和切口酶Cas9?D10A mRNA分别同这对sgRNA混合后注入小鼠一细胞期受精卵中,实现靶基因敲除,比较两种Cas9得到的F0代敲除小鼠的脱靶效应。结果：利用CRISPR/Cas9和Cas9?D10A成功建立Nsun5基因敲除小鼠模型,对两种Cas9得到的F0代突变小鼠进行潜在脱靶位点分析,均未检测到脱靶位点的存在。结论：两种策略都成功构建了不含脱靶位点的Nsun5基因敲除小鼠模型,为进一步研究Nsun5的生物学功能打下基础。     

m6A识别蛋白Ythdf1在精子发生中的作用研究

目的：构建YTH N6甲基腺苷RNA结合蛋白1（YTH N6?methyladenosine RNA binding protein 1,Ythdf1）的基因敲除小鼠,研究其在小鼠精子发生中的作用。方法：利用CRISPR/Cas9敲除技术及原核注射技术构建Ythdf1基因敲除小鼠模型,通过免疫荧光、HE染色对敲除小鼠睾丸及附睾进行形态学分析,通过交配实验进行生殖力测试,研究Ythdf1基因对雄性小鼠精子发生的影响。结果：RT?PCR结果显示,Ythdf1在1~8周龄雄鼠睾丸中均有表达;成功构建Ythdf1基因敲除小鼠;成年敲除小鼠精子发生、附睾及生育力均无异常。结论：在正常饲养情况下,敲除Ythdf1基因对雄性小鼠精子发生无影响。