应用CRISPR/Cas9 系统敲除PD-1 基因对人T 淋巴细胞增殖及分泌IFN-γ 的影响

[摘要] 目的：探讨应用CRISPR/Cas9 基因编辑系统敲除PD-1 基因对人T 细胞增殖及分泌IFN-γ 的影响。方法：设计靶向PD-1 基因的sgRNA 序列，应用T7 RNA聚合酶体外分别合成PD-1-sgRNA 和Cas9mRNA。利用核转染技术将PD-1-sgRNA 和Cas9 mRNA混合物转入激活的人T淋巴细胞，测序确认基因敲除的效率。应用流式细胞术分析基因敲除后T淋巴细胞表型和PD-1 的表达情况,锥虫蓝活细胞计数法检测T 细胞增殖活力,ELISA 检测T 细胞分泌IFN-γ 情况。结果：体外成功合成PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA。将PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA核转染T淋巴细胞，测序证实PD-1 基因序列编辑效率为58.3%。CRISPR/Cas9 系统成功下调T淋巴细胞表面PD-1 分子的表达水平[ （9.6±1.85）% vs（16.2±2.05）%，P<0.05]，PD-1 基因敲除不影响T 细胞的增殖活力和细胞表型(P>0.05)；但PD-1-sgRNA 组的效应T细胞分泌IFN-γ 水平显著升高(P<0.01)。结论：CRISPR/Cas9 基因编辑系统成功敲除人T淋巴细胞PD-1 基因，降低PD-1 分子表达可阻断PD-1／PD-L1 负性调控从而增强T细胞的免疫活性，且促进效应T细胞分泌IFN-γ。     

树突状细胞联合细胞因子诱导杀伤细胞治疗术后恶性黑色素瘤的疗效分析

目的 探讨树突状细胞联合细胞因子诱导杀伤细胞(DC-CIK)在治疗术后恶性黑色素瘤(MM)的疗效以及安全性分析. 方法 收集经病理确诊的MM患者77例,分为治疗组37例和对照组40例.对照组进行单纯手术治疗,治疗组于手术后进行DC-CIK治疗.对2组患者进行生存随访,比较2组患者的生存期、免疫功能和生活质量改善情况,观察不良反应,并进行预后相关因素的单因素和多因素分析. 结果 治疗组和对照组的中位生存期分别为45和29月,治疗组的总生存期显著高于对照组(P=0.018);2组的无进展生存期差别无统计学意义(P=0.245).治疗组患者的免疫功能和生活质量均得到显著改善,仅2例发生不良反应,且未达3/4级.是否有淋巴结转移(P=0.008)、是否进行DC-CIK治疗(P=0.02)以及治疗疗程数(P=0.031)是影响MM预后的独立预后因子. 结论 DC-CIK细胞免疫治疗可延长MM患者的生存期,提高其免疫功能,改善其生活质量,治疗过程安全性高,无明显副作用;治疗疗程多于4次时,疗效更好.     

天麻钩藤饮加减联合西药治疗肝硬化合并高血压的临床研究

目的观察天麻钩藤饮加减联合西药治疗肝硬化合并高血压的疗效及生存质量。方法收集在阜新市传染病医院肝病科治疗的肝硬化合并高血压患者160例,分为对照组80例和中西医结合治疗组80例。两组患者均进行抗病毒、抗纤维化等常规西医治疗。中西医结合治疗组在常规西医治疗的基础上给予中药治疗,观察患者治疗前后静脉血中亮氨酸氨基肽酶(LAP)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平变化情况并比较检测值的差异,对两组患者生存质量进行评估。结果两组患者治疗后LAP明显降低(P0.05),组间比较差异明显(P0.05);两组患者治疗后LDL-C明显降低(P0.05),组间比较差异明显(P0.05)。两组患者治疗后相比,中西医结合组焦虑抑郁水平改善明显,差异有统计学意义。中西医结合治疗组生活质量评分明显优于对照组,两组比较差异明显(P0.05)。结论天麻钩藤饮加减联合西药治疗肝硬化合并高血压的疗效较好,能够改善患者的生存质量,调整患者的心理状态,值得临床推广应用。     

CIK细胞联合常规治疗对肾透明细胞癌患者的临床疗效

目的:探讨DC-CIK细胞治疗肾透明细胞癌临床疗效及治疗次数对患者预后的影响.方法:回顾性分析2004年1月至2011年6月在福建省肿瘤医院诊疗的100例肾透明细胞癌患者,其中63例在福建省肿瘤生物治疗重点实验室进行自体DC-CIK细胞免疫治疗联合常规治疗为DC-CIK细胞治疗组,其余37例未经DC-CIK细胞治疗为对照组,比较两组患者的5年DFS和OS.治疗组按照DC-CIK细胞治疗疗程数分成≤3个疗程组及＞3个疗程组,分析DC-CIK细胞治疗疗程数对肾透明细胞癌患者5年DFS和OS的相关性.结果:DC-CIK细胞治疗组患者5年OS较对照组明显提高(81.05％ vs 60.29％,P＜0.05),但5年DFS无显著性差异(P＞0.05);DC-CIK细胞治疗疗程数＞3个的患者5年OS较对照组明显提高(P＜0.05),但5年DFS无显著性差异(P＞0.05).结论:自体DC-CIK细胞回输联合常规治疗手段治疗肾透明细胞癌更有生存优势,且DC-CIK细胞治疗疗程数与肾透明细胞癌患者的预后密切相关.     

Toll样受体-4表达对树突状细胞表型及功能的影响

目的:探讨Toll样受体-4(TLR-4)表达对树突状细胞(DC)表型及功能的影响及其机制.方法:以构建的含有TLR-4全基因序列的pcDNA3.1质粒载体为模板,通过mMESSAGE mMACHINE T7 Kit体外转录获得TLR-4 mRNA,并采用脂质体法将其转染健康人外周血PBMC来源的DC,用流式细胞术检测鉴定转染后DC表面功能性分子的表达及DC体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分泌细胞因子的能力.结果:成功构建人TLR-4-pcDNA3.1质粒载体;体外扩增成功人TLR-4和EGFP mRNA片段.TLR-4 mRNA转染后的DC表面趋化因子CCR7及功能性分子HLA-DR的表达显著高于control mRNA转染DC、转染前成熟DC[CCR-7:(42.4±4.93)％ vs (20.1±3.09)％、(17.1±4.33)％,P＜0.05;HLA-DR:(62.1±7.23)％ vs(17.7±6.01)％、(25.8±4.16)％,P＜0.05],同时转染后的DC体外诱导CTL分泌IFN-γ细胞因子的能力强于control mRNA-DC、空载转染DC诱导的CTL及加入DC前CTL[(66.5±3.58)％ vs (41.1±4.27)％、(37.9±2.96)％、(3.2±2.03)％,P＜0.05].结论:TLR-4 mRNA转染DC可显著增强DC的功能,提高了DC抗原提呈及诱导CTL的能力,为增强DC疫苗抗肿瘤效应提供实验依据.