微管末端结合蛋白1在Siha细胞自噬时的表达和意义

目的 探讨宫颈癌Siha细胞自噬过程中微管末端结合蛋白1（EB1）基因的表达变化。 方法 Hank平衡盐溶液（HBSS）和秋水仙素处理体外培养的宫颈癌Siha细胞,分别采用实时定量PCR和Western blotting检测EB1基因、LC3和p62的表达,荧光显微镜检测特异性绿色荧光蛋白（GFP)-LC3以证实自噬体形成。结果 宫颈癌Siha细胞随HBSS作用时间延长,LC3 mRNA、EB1 mRNA、LC3-Ⅱ蛋白和EB1蛋白的表达均呈时间依赖性增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。EB1 mRNA和LC3 mRNA表达呈正相关,具有统计学意义(P<0.05)。p62 mRNA和蛋白在HBSS作用后的表达呈时间依赖性降低,差异具有统计学意义(P<0.05),EB1 mRNA和p62 mRNA表达呈负相关,具有统计学意义(P<0.05)。GFP-LC3结果显示,在HBSS作用12 h后,Siha细胞胞质中GFP-LC3强度和数目明显增加,含有GFP信号的细胞数量也明显增加。秋水仙素处理后,LC3、p62和EB1 mRNA及蛋白均未发生显著改变,差异无统计学意义(P>0.05),但此时几乎检测不到含GFP-LC3荧光信号的细胞。 结论 EB1在饥饿状态Siha细胞中高表达,此时伴随LC3表达增加、p62表达降低以及自噬体形成增加,而用秋水仙素破坏EB1赖以作用的微管时,上述现象消失,充分表明EB1参与细胞自噬的可能。     

452例社区获得性肺炎病原学调查及细菌耐药情况分析

社区获得性肺炎（community acquired pneumonia,CAP）是威胁人类健康的常见感染性疾病之一,其病原体的组成和耐药特性在不同国家、不同地区之间存在着明显差异,而且随着时间的推移不断变迁。为了解这些变化,指导临床早期和合理用药,2008年9月至2010年9月我们对长寿区人民医院及重庆医科大学第二附属医院452例CAP住院患者进行了病原学及耐药情况调查,并进行统计分析,现报告如下。     

Lenti-eGFP体外转染兔角膜上皮细胞的实验研究

目的:观察慢病毒载体(Lentivirus vectors,LVs)介导的增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,eGFP)基因转染离体兔角膜上皮细胞对其生理功能的影响.方法:角膜上皮细胞的原代及传代培养并细胞鉴定.分正常细胞组(对照组)与转染细胞组.LVs介导的eG...     

蛋白酪氨酸激酶6对TNF-α诱导的人气道上皮屏障功能减损的影响北大核心CSCD

目的:探讨蛋白酪氨酸激酶6(PTK6)对TNF-α诱导的人气道上皮屏障功能减损的影响及相关机制。方法:体外培养人气道上皮16HBE细胞,予TNF-α刺激,分别转染PTK6 siRNA和recombined PTK6,以转染Scramble siRNA和Empty vector为对照。四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞活性;跨皮细胞组抗仪检测细胞跨皮细胞阻抗(TER);辣根过氧化物酶(HRP)流量法反应细胞通透性;RT-PCR检测ZO-1、Occludin mRNA水平;Western blot检测PTK6、ZO-1、Occludin、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)、磷酸化c-Jun氨基端激酶1/2(p-JNK1/2)和磷酸化p38(p-p38)蛋白水平。结果:TNF-α刺激后,细胞ZO-1、Occludin转录及蛋白水平、TER值显著降低,细胞通透性增高,同时PTK6、p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38蛋白水平显著增高(P<0.05);上调PTK6使ZO-1、Occludin转录及蛋白水平和TER值进一步降低,细胞通透性和p-JNK1/2、p-p38蛋白水平也进一步增高(P<0.05),但下调PTK6后上述指标呈相反变化(P<0.05);上调或下调PTK6对p-ERK1/2无明显影响。结论:下调PTK6可以降低JNK1/2、p38MAPK磷酸化水平,进而改善TNF-α诱导的气道上皮屏障功能减损。     

丹参、人参及蛤蚧组方对大鼠肺纤维化凋亡基因作用的研究

目的 研究丹参、人参及蛤蚧组方对博莱霉素致大鼠肺间质纤维化模型凋亡基因的表达,探讨该组方抗肺纤维化的作用机制.方法 SD雄性大鼠50只随机分为对照组、模型组、醋酸泼尼松组、治疗Ⅰ组(低剂量组:丹参83 mg/kg、人参50mg/kg及蛤蚧50mg/kg)及治疗Ⅱ组(高剂量组:丹参166mg/kg、人参50mg/kg及蛤蚧50 mg/kg);于第28天处死大鼠,RT-PCR 法检测大鼠肺组织bax及bcl-2基因mRNA表达水平,用单克隆抗体免疫组化法检测bax及bcl-2蛋白含量.结果 bax基因mRNA及蛋白在模型组、醋酸泼尼松组、治疗Ⅰ组及治疗Ⅱ组的表达明显升高,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);同时模型组升高幅度明显,治疗Ⅱ组升高幅度较低,两者相比差异有统计学意义(P ＜0.01);bcl-2基因mRNA及蛋白在醋酸泼尼松组、治疗Ⅰ组及治疗Ⅱ组的表达升高,并治疗Ⅱ组升高更明显,与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 丹参、人参及蛤蚧组方能通过调节细胞凋亡,下调bax活性,增强Bcl-2的活性,抑制细胞凋亡,减少纤维积聚和纤维化形成.     

ROS／Src／JNK信号通路在香烟诱导气道上皮细胞黏液高分泌中的作用

目的 探讨在香烟诱导气道上皮细胞黏蛋白MUC5AC表达过程中Src/JNK信号通路的作用.方法 香烟抽提物预处理的人气道上皮A549细胞,分别以活性氧(ROS)清除剂DMTU、JNK特异性抑制剂SP600125及Src激酶抑制剂PP2干预.测定各组细胞中ROS的含量,采用RT-PCR、ELISA法观察细胞黏蛋白(MUC)5AC转录水平及培养上清液中MUC5AC蛋白水平的改变,以Western blot法检测细胞表皮生长因子受体(EGFR)的蛋白表达.结果 细胞暴露于不同浓度的香烟抽提物中,ROS的量呈浓度递增;ROS清除剂DMTU显著降低香烟所致的Src磷酸化;Src特异性抑制剂PP2处理组中的JNK磷酸化水平与对照组比较有明显下降,MUC5AC的表达水平也明显降低;JNK特异性抑制剂SP600125组中MUCSAC的蛋白表达和基因转录水平较对照组均明显降低.结论 ROS-Src-JNK信号通路可能参与A549上皮细胞中MUCSAC的表达调控.     

依赖Ca2+的ATP过量释放在机械牵张所致气道上皮黏蛋白5AC高分泌中的作用

目的探讨人气道上皮细胞三磷酸腺苷(ATP)释放量的改变在机械通气所致气道黏液高分泌中的作用。方法人气道黏膜上皮细胞(HBE16)体外培养,通过节律性倾斜细胞培养板,利用液体的表面张力、大气压及液体重力所产生的牵张力(剪应力)及压力(压应力)给予压力牵张刺激,并利用向密闭盒中注入医用氧气增加压力以模拟机械通气,各组培养细胞依施加条件不同而分为对照组、单纯倾斜组、倾斜+钙离子螯合剂BAPTA-AM、倾斜+BAPTA-AM+钙离子螯合剂EGTA、加压+倾斜、加压+倾斜+嘌呤P2Y受体阻断剂reactive blue-2(RB-2)、加压+倾斜+BAPTA-AM、加压+倾斜+BAPTA-AM+EGTA,共8组,分别采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定细胞活性、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组黏蛋白(MUC)5AC mRNA表达水平、ELISA法检测细胞培养上清液中MUC5AC含量、高效液相色谱法(HPLC)检测培养液中ATP释放量。结果加压+倾斜组细胞MUC5AC mRNA相对含量、培养上清液中ATP释放量和MUC5AC蛋白分泌量分别为:(11.80±0.01)、(7.41±0.45)μmol/g、(0.77±0.26),显著高于单纯倾斜组的(6.60±0.01)、(2.76±0.47)μmol/g、(0.25±0.01)及对照组的(3.40±0.01)、(0.00±0.01)μmol/g、(0.02±0.01)(均P<0.05)。RB-2、EGTA+BAPTA-AM处理后的加压+倾斜组细胞的MUC5AC mRNA相对含量分别为:(10.5±0.03)、(11.9±0.11),与加压+倾斜组相比抑制作用不显著(P>0.05);培养上清液中ATP释放量分别为:(0.05±0.02)μmol/g、(0.08±0.02)μmol/g,较加压+倾斜组显著降低(均P<0.05)。结论机械通气可以显著提高气道黏膜上皮MUC5AC的分泌,其机制与气道上皮细胞依赖Ca2+的ATP的过量释放密切相关。     

阿奇霉素通过抑制Th17细胞功能活性改善小鼠哮喘炎症

目的 研究阿奇霉素对Th17应答增强致气道以中性粒细胞浸润为主的小鼠哮喘炎症的作用.方法 采用卵蛋白(OVA)+内毒素(LPS)联合致敏,OVA激发的方法建立Th17应答增强致气道中性粒细胞浸润为主的哮喘小鼠模型,48只BALB/c雌性小鼠随机分为对照组、哮喘组、阿奇霉素组、地塞米松组(n=12).采用HE染色观察肺组织病理改变;小鼠肺功能仪检测气道高反应性(airway hyperreactivity,AHR);肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)行细胞分类计数;ELISA检测外周血OVA特异性IgE及BALF中IL-17、TNF-α、IL-8、IL-5和IFN-γ浓度;Q-PCR检测肺组织Th1、Th2和Th17细胞分化.结果 用OVA联合LPS的方法可以复制既有Th2活化和肺内嗜酸性细胞增多,又有Th17表达增强和明显中性粒细胞炎症的哮喘小鼠模型.与哮喘组比较,阿奇霉素组气道炎症细胞浸润明显改善,特别是中性粒细胞比例显著降低(P＜0.05).同时还有BALF中IL-17、TNF-α、IL-8、IL-5水平显著降低(P＜0.05);肺组织Th17细胞分化减少(P＜0.05)以及AHR改善(P＜0.05).而地塞米松组与哮喘组比较,虽然BALF嗜酸性细胞比例显著降低,但BALF中细胞总数、IL-17、TNF-α、IL-8水平及肺组织Th17细胞分化均无明显差别(P＞0.05).结论 阿奇霉素可抑制Th17细胞分化、减少炎症介质分泌从而抑制炎症细胞浸润,由此减弱Th17应答增强致气道中性粒细胞增高的小鼠哮喘炎症.     

构建以Th17应答为主致气道中性粒细胞增高的小鼠哮喘模型

目的建立一种Th17应答增强致气道炎症以中性粒细胞浸润为主的哮喘动物模型。方法卵蛋白(ovalbumin,OVA)和内毒素(lipopolysaccharide,LPS)联合致敏构建新哮喘模型。末次激发24 h后行肺功能测定,评估气道高反应性(airway hyperresponsiveness,AHR)。肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)分类计数气道炎症细胞比例,肺组织切片HE染色观察病理改变。Q-PCR检测肺组织Th1、Th2和Th17细胞偏移情况。结果 OVA和LPS联合致敏可以诱发更剧烈的AHR。BALF分类计数显示嗜酸性粒细胞(EOS)和中性粒细胞(NEU)比例分别为(16.09±4.42)%和(28.63±8.89)%。病理学观察可见明显的哮喘样炎症改变。Q-PCR结果显示单独OVA致敏肺内T细胞主要向Th2方向偏移,联合致敏以向Th17方向偏移为主。结论成功构建以Th17应答占优势、肺内炎症以中性粒细胞浸润为主的哮喘动物模型。     

乳腺增生病的中医证素研究

目的探讨胰岛素通过SGKl对LPS诱导的急性肺损伤状态下的钠离子通道的调节作用。方法30只雄性Wistar大鼠随机平均分为对照组（Control组）、治疗组（LPS＋Insulin组）和模型组（LPS组）每组10只。记录5个时间点（O、0．5、1、3、6h）大鼠的血糖水平,并使用胰岛素使LPS＋Insulin组大鼠血糖控制在1．5到4．5mmol／L。通过HE染色观察肺组织病理学改变;使用湿／干比（W／D）分析肺水肿程度;使用RT-PCR、Westernblot和免疫组织化学对a-ENac的表达进行测量;SGKl和磷酸-SGKl（phospho-SGKl）蛋白表达使用Westernblot进行定量分析。结果大鼠注射LPS后血糖明显上升并于3h达到最大值。LPS干预6h后大鼠肺损伤评分和w／D比值明显增加,a-ENaC表达量和磷酸化-SGKl水平明显下降,差异有显著统计学意义。同时发现,LPS＋Insulin组大鼠肺损伤评分和W／D比值较LPS组大鼠稍低,而α-ENaC表达量和磷酸化-SGKl水平较之升高,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论胰岛素可以有效减轻LPS诱导的大鼠ARDS导致的肺水肿,其机制可能与促进SGKl的活化后上调了ENaC的表达相关。该结果为应用胰岛素治疗肺水肿奠定了理论基础。