木犀草素对原发性硬化性胆管炎治疗作用研究

目的 探讨木犀草素对3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢-2,4,6-三甲基吡啶（3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine,DDC）诱导的原发性硬化性胆管炎（primary sclerotic cholangitis,PSC）的治疗作用及可能机制。方法 将6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机均分成空白对照组、DDC组、DDC+木犀草素组和木犀草素组,每组各6只。DDC组和DDC+木犀草素组小鼠使用0.1% DDC饲料喂养2周,造模成功后改用正常饲料喂养。自第15天起,DDC+木犀草素组和木犀草素组小鼠给予木犀草素40mg/kg连续灌胃20d,每天一次。其余组在此期间正常饲料喂养。比较各组小鼠血清丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、总胆汁酸（total bile acid,TBA）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）水平;苏木精–伊红染色（hematoxylin and eosin staining,HE染色）观察肝组织病变程度;检测小鼠肝组织炎症因子[白细胞介素（interleukin,IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）]和纤维化相关因子[α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ）、基质金属蛋白酶抑制剂1（matrix-metalloproteinase inhibitor 1,Timp1）]mRNA表达情况;蛋白质印迹法检测p65和p-p65蛋白活化情况。结果 DDC组小鼠的血清ALT、AST、TBA及ALP均显著高于空白对照组（P<0.05）,DDC+木犀草素组小鼠的血清ALT、AST、TBA及ALP均显著低于DDC组（P<0.05）。HE染色病理切片可见,空白对照组小鼠的肝细胞排列规则,形态正常,无胆汁淤积及炎细胞浸润;DDC组小鼠的肝细胞排列紊乱,胆管周围出现炎症浸润,大量胆汁淤积并伴有小胆管增生;DDC+木犀草素组小鼠的肝组织相较于DDC组胆汁淤积程度减轻,炎症浸润面积减小,且小胆管增生情况得到抑制。DDC组小鼠的IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、α-SMA、collagen Ⅰ、Timp1的mRNA表达均显著高于空白对照组（P<0.05）,DDC+木犀草素组小鼠的IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、α-SMA、collagen Ⅰ、Timp1的mRNA表达均显著低于DDC组（P<0.05）。DDC组小鼠的p-p65蛋白活化水平显著高于空白对照组（P=0.002）,经木犀草素治疗后,p-p65蛋白活化水平下降（P=0.012）。结论 木犀草素对DDC诱导的PSC有一定的治疗作用,其作用机制可能与核因子-κB信号通路有关。     

A20介导TNF-α炎症微环境下髓核细胞衰老的机制研究

目的 :探讨锌指蛋白A20[也称为肿瘤坏死因子诱导蛋白3(tumor necrosis factor-induced protein 3,TNFAIP3)]在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)炎症微环境下髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)衰老发生机制。方法:体外分离培养SD大鼠髓核细胞。实验分为三组:正常对照组(只加入正常培养基)、TNF-α干预组(加入不同浓度的TNF-α,10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)和自然衰老组(在体外通过细胞不断增长传代至P20代)。应用CCK-8细胞增殖实验﹑β半乳糖苷酶染色﹑Western blot(WB)、QT-PCR、immunofluorescence(IF)从基因、蛋白及细胞功能水平评估髓核细胞衰老变化。应用WB、QT-PCR和IF检测锌指蛋白A20﹑NF-κB(p65)﹑NF-k B(p-p65/phospho S536)表达情况。结果 :与正常对照组相比,TNF-α干预48h、72h后髓核细胞的增殖能力明显降低;TNF-α干预组和衰老组β半乳糖染色阳性率较对照组明显增高;QT-PCR结果提示,与对照组比,TNF-α干预组p53表达增加(P0.05),而A20表达随着TNF-α浓度增高而降低;衰老组A20表达较对照组减少,而p53扩增升高。WB检测显示:TNF-α可以诱导p53﹑A20、p-p65表达上调,而A20表达随着TNF-α浓度增加而降低;同时衰老组A20表达较对照组减少,而p-p65和p53表达增加(P0.05);IF显示:与对照组对比,TNF-α处理下A20﹑p-p65表达增加,但是A20的表达随着TNF-α增加而降低,衰老组A20较对照组也明显降低,p-p65表达增加。结论:髓核细胞衰老程度与TNF-α干预存在剂量关系,TNF-α可以刺激髓核细胞A20表达升高,并激活NF-κB信号通路。而A20表达情况受细胞衰老程度影响,随着髓核细胞衰老A20所参与的作用效能逐渐减低。