异时连体共生对小鼠椎旁肌肉衰老退变的影响

目的 :通过异时连体共生(heterochronic parabiosis,HP)模型检测年轻小鼠血液循环环境对年老小鼠脊柱椎旁肌肉的影响。方法:选择4月龄的年轻小鼠及18月龄年老雌性小鼠,通过手术建立年轻和年老小鼠同时(isochronic parabiosis,IP)、异时连体共生模型。连体8周后将小鼠分成同时连体年轻小鼠组(youngisochronic,YI),异时连体年轻小鼠组(young heterochronic,YH);同时连体年老小鼠(old isochronic,OI)和异时连体年老小鼠组(old heterochronic,OH)4组,解剖并提取椎旁肌肉。通过流式细胞仪吸光度检测各组椎旁肌肉糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)及各组DNA的含量,提取肌肉组织蛋白行蛋白印痕(Western blot)检测衰老基因P53、P21、P16及自噬基因LC3、金属蛋白酶MMP13基因的表达。取脊柱椎旁肌肉组织进行组织免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测Aggrecan、P16及炎症因子IL8的表达差异性。结果:GAG定量分析显示YI、YH、OH、OI各组分别为2.91±0.17、2.01±0.21、2.23±0.36、1.18±0.09,其中YI与YH、OH与OI组之间有统计学差异(P0.05);通过IF检测Aggrecan表达呈下降趋势,YI、YH、OH、OI各组分别为717.25±64.44、611.59±28.45、683.04±17.95、570.34±31.81,其中OH与OI组间有统计学差异(P0.05),YI与YH组间无统计学意义(P0.05);LI8基因表达YI、YH、OH、OI各组分别为494.20±28.35、561.62±44.72、602.35±45.57、726.36±58.40;P16基因表达YI、YH、OH、OI各组分别为701.30±27.21、695.92±31.06、754.82±25.78、815.54±24.70,有上升趋势但YI与YH、OH与OI组间无明显差异(P0.05)。Western blot检测自噬基因LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达呈下降趋势YI、YH、OH、OI各组分别为0.39±0.09、0.29±0.05、0.26±0.04、0.16±0.01;衰老基因P21蛋白表达YI、YH、OH、OI各组分别为1.09±0.23、1.32±0.12、1.54±0.03、1.86±0.06;金属蛋白酶MMP13蛋白表达YI、YH、OH、OI组分别为0.59±0.11、0.68±0.13、0.88±0.15、1.11±0.18。在LC3Ⅱ/Ⅰ、P21、MMP13表达中,YI与YH组间无明显差异性(P0.05),OH与OI组间有统计学差异(P0.05)。结论:全身血液循环可以影响椎旁肌肉退变,年轻血液环境可以延缓年老小鼠脊柱椎旁肌肉衰老退变。     

黄芩素对A431细胞埃兹蛋白表达及侵袭力的影响

目的 探讨黄芩素是否通过抑制埃兹蛋白来实现抑制A431细胞增殖、细胞周期进程及伪足的形成。方法 采用细胞划痕、微孔滤膜法（Transwell）检测黄芩素对A431细胞爬行的影响;RT－PCR检测黄芩素对A431细胞埃兹蛋白mRNA表达量的影响;Western印迹检测黄芩素及siRNA对A431细胞埃兹蛋白表达及其磷酸化的影响;扫描电镜观察黄芩素及siRNA对A431细胞伪足形成的影响。结果 细胞划痕实验显示,培养24 h时,黄芩素 5、10、20 μmol/L组细胞闭合宽度占原宽度的比例分别为13.3% ± 1.7%、7.6% ± 1.6%和5.9% ± 1.3%,黄芩素呈浓度依赖性抑制A431细胞爬行运动,黄芩素各组与阴性对照组（16.3% ± 2.3%）比较,差异均有统计学意义。Transwell实验证实,5、10、20 μmol/L黄芩素处理A431细胞48 h后,穿过人工基底膜的细胞数量分别为（46.5 ± 3.8）、（34.3 ± 3.4）和（25.3 ± 2.3）个/Hp,各处理组与阴性对照组（56.3 ± 3.8个/Hp）经方差分析,P < 0.01;而与siRNA组（28.3 ± 2.1个/Hp）比较,P > 0.05。Western印迹及RT－PCR检测显示,0、5、10、20、40 μmol/L黄芩素处理A431细胞48 h后,黄芩素呈浓度依赖性地抑制A431细胞埃兹蛋白/磷酸化埃兹蛋白及埃兹蛋白mRNA表达,埃兹蛋白mRNA与β-肌动蛋白mRNA灰度值之比值与阴性对照组比较,P值均 < 0.01;而与siRNA组比较,P > 0.05;埃兹蛋白、磷酸化埃兹蛋白在A431细胞中的表达量（与β-肌动蛋白灰度值之比）与阴性对照组比较,P值均 < 0.01;而40 μmol/L黄芩素处理组与siRNA处理组比较,P > 0.05。扫描电镜显示,48 h后20 μmol/L黄芩素组A431细胞伪足数量为（5.3 ± 1.9）个,长度明显缩短,与阴性对照组（22.6 ± 2.8个）比较,P < 0.01;siRNA组为（4.5 ± 2.8）个,与阴性对照组比较,P > 0.05。结论 黄芩素可能通过直接或间接抑制埃兹蛋白表达及其磷酸化而抑制A431细胞的增殖、爬行,从而达到抗肿瘤增殖及浸润转移的目的。