α-鹅膏毒肽诱导肝细胞毒性作用机制的研究进展

鹅膏菌是一类可引起急性中毒的蘑菇种属,90％以上野生菌中毒死亡事件均由鹅膏毒肽引发,α-鹅膏毒肽（α-amanitin、α-AMA）是其中毒性最强的成分,肝脏是其毒性靶器官。RNA聚合酶Ⅱ（RNA pol Ⅱ）转录抑制是α-鹅膏毒肽导致肝细胞损伤的公认机制,但其他可能的毒理学机制尚待阐明。主要从α-鹅膏毒肽诱导肝细胞凋亡、自噬、炎症、氧化应激等毒性机制,中毒后临床治疗等方面进行综述,旨在为鹅膏毒肽中毒研究以及防治提供新的思路。     

pTet-on骨骺干细胞株的建立和pTRE-甲状旁腺相关蛋白(1-36)反应质粒的构建

目的 建立pTet-on骨骺干细胞株,克隆甲状旁腺相关蛋白[PTHrP(1-36)]基因并构建反应质粒pTRE-PTHHrP(1-36).方法 用脂质体介导的基因转染技术将pTet-on质粒转染于永生化骨骺干细胞,G418筛选得到稳定克隆,再瞬时转染pTRE-2Hyg-Luc质粒并筛选出高水平诱导、低背景表达的永生化骨骺干细胞系.以RT-PCR方法获得带有酶切位点PTHrP(1-36)基因片段,与载体pTRE-2Hyg均双酶切后连接,转化扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定.结果 筛选到1株诱导后荧光素酶的表达活性增加50倍的骨骺干细胞系;经酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已经插入重组质粒.结论 筛选得到的永生化骨骺干细胞株受强力霉素诱导后能够低背景、高水平表达;成功克隆PTHrP(1-36)基因并构建了反应质粒pTRE-PTHrP(1-36),为进一步精确调控PTHrP(1-36)基因的表达奠定了基础.     

壳聚糖/纳米羟基磷灰石分层复合支架的生物相容性研究

制备壳聚糖/纳米羟基磷灰石(CS/nHA)分层复合支架,对其进行细胞毒性评价.分离培养大鼠软骨细胞接种于支架,相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附及生长情况.动物皮下埋植试验观察其组织相容性.实验结果证实壳聚糖/纳米羟基磷灰石分层复合支架具有良好的生物相容性,有望成为较好的骨软骨组织工程支架.     

生长分化因子5诱导大鼠软骨前体细胞向成软骨方向分化

背景：生长分化因子5和软骨前体细胞都在肢体纵向发育中发挥重要作用。目前尚无生长分化因子5对软骨前体细胞影响的文献报道。 目的：实验创新性构思重组生长分化因子5干预软骨前体细胞,希望得到生长分化因子5诱导软骨前体细胞向软骨细胞分化的证据。 设计、时间及地点：细胞形态学体外实验,于2007-11/2008-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科研究室完成。 材料：纯系清洁级新生 24 h 内的 SD 大鼠 12 只,用于制备软骨前体细胞。生长分化因子5为PeproTech公司产品。 方法：免疫磁珠分离纯化软骨前体细胞。取第3代细胞,分别用含0,10,50和100 μg/L的完全软骨形成培养基干预,诱导14 d。对照组采用低糖DMEM培养基。 主要观察指标：光镜观察细胞形态和生长增殖,四甲基偶氮唑盐检测细胞增殖活性,阿利新蓝染色蛋白聚糖,应用免疫组织化学和反转录-聚合酶链反应检测Ⅱ型胶原的表达。 结果：分离纯化的软骨前体细胞贴壁牢固,生长旺盛,折光度好,光镜下呈多角形或梭形。 软骨前体细胞的增殖在48 h内呈剂量依赖性增高,100 μg/L生长分化因子5组细胞的增殖率显著高于其他组(P < 0.05)。诱导14 d后阿利新蓝染色阳性,细胞外基质中有明显的蛋白聚糖形成。在生长分化因子5干预软骨前体细胞第7天,Ⅱ型胶原mRNA和Ⅱ型胶原蛋白出现表达,并且14 d持续表达。 结论：生长分化因子5能够促进软骨前体细胞的增殖分化。     

新生大鼠前软骨干细胞株的体外培养分选、鉴定及永生化研究

背景：前软骨干细胞虽然具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能，但生物学性状不稳定，易分化。导入外源性基因能使其永生化，且不改变细胞的表型和性状。 目的：建立永生化大鼠前软骨干细胞株，为以后精确调控前软骨干细胞的增殖与分化打下基础。 设计、时间及地点：单一样本观察，于2005-10/2006-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成。 材料：出生< 24 h的新生SD大白鼠，雌雄不限，用于取前软骨干细胞。 方法：用LipofectamineTM2000介导基因转染，将含有SV40T抗原基因的真核表达载体pCMVSV40T/PUR导入经免疫磁珠分选出的原代前软骨干细胞进行稳定表达，用嘌呤霉素筛选出阳性克隆并扩大培养。 主要观察指标：①前软骨干细胞的生物学性状。②质粒鉴定。③用免疫细胞化学方法和反转录聚合酶链反应鉴定SV40T抗原基因在转染细胞中的表达。④反转录聚合酶链反应结果。⑤细胞生长曲线。 结果：①免疫磁珠分离获得细胞阳性克隆，用免疫组织化学证实FGFR-3表达阳性。②双酶切质粒，电泳证实pCMV为3 kb，SV40T基因为2.3 kb。③嘌呤霉素分离获得转化后细胞阳性克隆，用免疫组织化学证实FGFR-3表达阳性。④提取RNA后用反转录-聚合酶链反应法成功扩增出588 bp的片段。转染细胞经扩大培养，命名为永生化前软骨干细胞。⑤贴壁培养的转染细胞群体倍增时间为 (22.98±2.77) h，传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。 结论：在体外培养条件下，可以从新生大鼠干骺端中分离、培养出前软骨干细胞，pCMVSV40T/PUR转染能使其永生化。     

3D打印技术在脊柱外科留学生教学中的应用

近20年来,我国的高等教育水平的迅速提高,来我国留学的学生的数量也在急剧增多,其中就包含了大量医学专业的留学生。留学生的教育背景及思维方式与我国学生有显著差异,使用我国传统的教学方法难以收到良好的教学效果。3D打印技术是近年来发展迅猛的新技术,已经被广泛的应用于医学领域,它可以精准复制脊柱外科疾病的实物模型,促进师生互动,可有效地化解脊柱外科教学及临床实践的难点,加深留学生对脊柱外科疾病的认识和理解,显著缩短了学习曲线,提高了教学质量,为越来越多的医学专业留学生成为优秀的脊柱外科医师奠定了基础。     

Blocking Ihh signaling pathway inhibits the proliferation and promotes the apoptosis of PSCs

Summary： The roles of Indian hedgehog （Ihh） signaling pathway in the proliferation and apoptosis of precartilaginous stem cells （PSCs） were investigated. PSCs, labeled with fibroblast growth factor receptor 3 （FGFR-3）, were isolated from neonatal rats by immunomagnetic separation. After identification with FGFR-3 and Col II, the cells were incubated with different concentrations of cyclopamine （cyclo）, the specific inhibitor of Ihh signaling pathway. The morphologic changes of the cells were observed under the inverted phase contrast microscope. The mRNA expression levels of Ihh, parathyroid hormonerelated peptide （PTHrP）, protein Patched （Ptch）, Bcl-2 and p21 were detected by RT-PCR. The protein expression levels of Ihh and Ptch were measured by Western blot. MTT assay was used to examine the effects of cyclo on proliferation of PSCs. Apoptosis rate of PSCs was examined by AnnexinV/PI assay of flow cytometric analyses. After PSCs were incubated with cyclo, obvious morphologic changes were observed as compared with the control group. The mRNA expression levels of PTHrP, Ptch and Bcl-2 were decreased to varying degrees in a cyclo dose-dependent manner. However, the expression levels of Ihh and p21 mRNA were increased. The protein expression of Ptch and Ihh had the same change as the mRNA expression. Meanwhile, cyclo could obvi- ously inhibit the proliferation and promote the apoptosis of PSCs. The results indicated that Ihh signaling pathway plays an important role in regulating the proliferation and apoptosis of PSCs, which is probably mediated by Bcl-2 and p21.     

骨骺干细胞复合壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架体外培养的实验研究

目的 探讨免疫磁珠分选的骨骺干细胞(PSCs)经诱导后向软骨细胞方向分化的性能,及其与壳聚糖/纳米羟基磷灰石(CS/nHA)支架材料复合培养构建组织工程化软骨的可行性.方法 用显微手术器械剪取新生24 h内的清洁级SD大鼠股骨下端骺板两端的La Croix环处组织,应用免疫磁珠分选系统分离纯化PSCs,免疫荧光染色观察PSCs成纤维细胞生长因子受体-3(FGFR-3)的表达情况.体外培养并诱导PSCs向软骨细胞特性方向分化,免疫细胞化学、甲苯胺兰及番红O染色检测诱导后细胞Ⅱ型胶原及软骨基质的表达情况.以诱导后接种于CS/nHA支架培养的PSCs为实验组,以诱导后未接种支架的细胞为对照组.扫描电镜观察细胞的黏附及形态学改变,MTT法检测细胞增殖情况,阿辛蓝法测定细胞合成的糖胺多糖(GAG)情况.对两组间不同培养时间的吸光度值及GAG进行比较.结果 免疫磁珠分选的PSCs体外培养增殖迅速,免疫荧光染色显示FGFR-3阳性表达.诱导后的PSCsⅡ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺兰染色及番红O染色均旱阳性.细胞接种CS/nHA支架后1、4 d,实验组与对照组吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05),而7 d实验组与对照组吸光度值比较筹异有统计学意义(t=-2.786,P=0.024).培养14 d后培养液GAG含量为(89.66±6.52)μg/106个细胞,高于对照组[(78.62±4.63)μg/106个细胞)],差异有统计学意义(t=-3.084,P<0.05).结论 免疫磁珠分选的PSCs经诱导后可向软骨细胞功能方向分化,诱导后的PSCs与CS/nHA分层支架复合有望构建组织工程化软骨.     

骨骺干细胞相关研究进展

骨骺干细胞是近年来发现的保持有干细胞特性并能定向分化的成体干细胞之一,它的分离纯化使得尚未找到十分理想的种子细胞的关节软骨损伤组织工程修复研究看到了希望.研究发现PTHrP、Ihh和Notch等信号转导系统在调节骨骺干细胞分化和软骨内成骨中起着重要作用.软骨发育不良、原发性滑膜软骨瘤等多种软骨发育障碍性疾病与骨骺干细胞的特征性标记物成纤维细胞生长因子受体-3的基因突变有关.骨骺干细胞在修复软骨与骨缺损方面的研究已取得可喜进展,在未来临床研究中将有广泛的应用价值.