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[目的]探讨应用生长分化因子5(growth differentiation factor 5,GDF-5)诱导人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSCs)微团成软骨分化的可行性及效果。[方法]体外分离培养hMSCs,取第3代细胞实验。将hMSCs分别用无血清H-DMEM和含10、20、50、100 ng/ml GDF-5的软骨诱导液(chondrogenic medium,CM)诱导,显微镜下观察细胞形态变化,MTT法检测各组细胞的增殖情况。诱导2周后重悬细胞,以5×106/ml的细胞密度离心构建微团,继续诱导2周。RT-PCR检测两组细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达。免疫组化、甲苯胺蓝染色检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达。[结果]hMSCs呈梭形、漩涡状生长。100 ng/ml GDF-5诱导的hMSCs呈圆形或多角形。五组微团分别由无血清H-DMEM、含10,20,50,100 ng/ml GDF-5的软骨诱导液诱导2周后,除H-DMEM组无Ⅱ型胶原mRNA、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的表达外,其他各组Ⅱ型胶原mRNA、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的表达呈... 相似文献
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目的 探讨低氧环境下生长分化因子-5 (GDF-5)诱导人骨髓基质干细胞(hBMSCs)“自组装”形成工程化软骨的可行性和有效性。方法 分离培养hBMSCs,流式细胞学方法鉴定。将hBMSCs用含100 ng/mL GDF-5软骨诱导液(CM)分别在低氧(A组)和正常氧(B组)环境下诱导培养3周,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和Aggrecan表达情况。将A、B两组hBMSCs消化后,按一定密度接种于2%琼脂糖包被的24孔板,在不同氧浓度下CM继续诱导3周,免疫组化法检测组织Ⅰ、Ⅱ型胶原表达,甲苯胺蓝染色检测葡萄糖胺聚糖(GAG)表达。结果 hBMSCs呈梭形漩涡状生长,高表达CD44、CD29,不表达CD45分子。诱导5d后A组细胞较B组明显增殖,诱导10dA组细胞体积较B组小。含GDF-5的CM诱导hBMSCs 3周后,Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA表达阳性,A组Ⅱ型胶原和Aggrecan表达量较B组均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。GDF-5诱导hBMSCs可“自组装”形成一定形状大小类软骨样组织,A组Ⅱ型胶原表达较B组增加,A组Ⅰ型胶原表达量下降,B组表达阳性;A组甲苯胺蓝染色异染加深。结论 低氧促进GDF-5诱导hBMSCs向软骨分化,低氧环境下GDF-5诱导软骨分化的hBMSCs“自组装”形成的工程化软骨更具有软骨表型。 相似文献
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生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化 总被引:1,自引:1,他引:0
背景:生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子,在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用.目的:小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA 3.1(+),生长分化因子5,检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成.材料:雄性昆明种小鼠20只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.生长分化因子5真核表达质粒pCDNA 3.1(+)/生长分化因子5为自备.方法:全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞接种到6孔板,在细胞生长到90%融合时开始转染.设立3组:转染组采用Lipofectamine<'TM>2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染;空质粒组转染窄质粒pcDNA 3.1(+);空白对照组只加入等量脂质体,其余步骤相同.主要观察指标:转染后72 h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功,同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达,转染后14 d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达.结果:转染组有一大小为219 bp的特异性扩增条带,骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色;而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录,无特异性扩增条带,且细胞胞浆未见明显染色.转染组町检测到Ⅱ型胶原基因的表达,基因大小225 bp,Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色;空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达,SP染色均无明显染色.阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色.结论:pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达,促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化. 相似文献
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[目的]探究以人骨髓间充质干细胞(humanbonemarrowmesenchymalstemcells,hMSCs)为种子细胞体外构建“自组装”工程化软骨对应的合理细胞接种密度.[方法]体外分离与培养hMSCs.用含100ng/ml生长分化因子5(growthdifferentiationfactor5,GDF-5)的软骨诱导液(chondrogenicmedium,CM)定向诱导培养第3代hMSCs,诱导3周后重悬细胞,分别以A组2.5×106/ml,B组5×106/ml,C组1x107/ml,D组2×107/ml四种细胞密度接种于2%琼脂糖包被的24孔板,每组设5个复孔.自组装培养3周后,对标本进行大体观察、组织学及免疫组化检测并进行生化分析,比较不同组标本的软骨生物学特性的差异.[结果]“自组装”培养3周后,各组都形成了软骨样组织团块,团块直径与湿重随细胞接种密度而增加.Bem评分结果显示C、D两组明显高于A、B两组(P<0.05),且C组与D组间差异无统计学意义,Ⅱ型胶原免疫组化染色检测到C组与D组细胞外基质内有较强的阳性信号弥漫分布,蛋白多糖(GAG)含量C、D两组亦明显高于A、B两组(P<0.05),且C组与D组间差异无统计学意义.[结论]在一定细胞接种密度范围内,“自组装”工程化软骨的生物学特性呈密度依赖性增加.以1×107/ml接种时,可以获得具有良好生物学特性的“自组装”工程化软骨. 相似文献
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背景:骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2) 是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子,被认为是最具有前途的骨诱导物质。
目的:构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。
设计、时间及地点:自身对照实验,于2005-07/2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。
材料:pcDNA3.1(+)载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠;成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。
方法:从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA,利用反转录-聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA,将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM-T- hBMP-2重组质粒载体,转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T- hBMP-2质粒和pcDNA3.1真核表达载体,将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3.1真核表达载体,提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后,用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞,反转录-聚合酶链反应检测BMP-2的表达。
主要观察指标:①人骨肉瘤细胞总RNA 反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM-T-hBMP-2 和pcDNA3.1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。
结果:人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后,获得1.2 kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因,重组质粒pcDNA3.1- hBMP-2构建正确;该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。
结论:实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。 相似文献
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BiCONTACT全髋假体在欧洲应用于临床已有15年历史,术后效果满意。Ito1978年研究指出,日本髋关节骨性关节炎患者中90.2%由髋关节发育不良引起,主要表现为髋外翻、髓腔过窄、过度前倾、股骨头变小、臼窝变窄变浅和出现假髋臼,后者常伴有股骨头半脱位。严重时患者会出现组件侧方支持的缺乏,增加了假体无菌性松动的危险性。解快上述问题的方法:①髋臼的重建;②植骨和髋臼组件螺钉内固定。该文详细阐述了多螺钉固定臼杯和移植 相似文献
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长期以来对股骨髁坏死的治疗一般采用胫骨高位截骨、半膝和全膝关节置换等方法。自1908年Lexer首先报道采用自体骨软骨移植来治疗股骨髁坏死后,许多学者也相继有报道。然而这种方法的长期临床效果至今无人报道。该研究对16例股骨内侧髁坏死而行自体骨软骨移植的病人进行回顾,其中男性14人,女性2人,平均年龄64.9岁(58~74岁),12个膝为Lotke 1-B级,4个膝为Lotke 1-C级,股胫角在178°~190°之间,平均随防时间为67个月 相似文献
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经皮穿针和逆行髓内针固定治疗肱骨近端骨折 总被引:1,自引:0,他引:1
目的探讨经皮穿针和逆行髓内针固定治疗肱骨近端骨折的临床效果。方法1999年6月-2003年12月对29例肱骨近端骨折分别采用经皮穿针内固定21例,逆行髓内针固定5例,经皮穿针和逆行髓内针固定3例。结果术后无针眼感染、血管损伤、医源性桡神经损伤、螺纹针折断,未出现肱骨头坏死的征象。1例行经皮穿针内固定出现腋神经损伤症状,经治疗2个月后症状消失。29例术后8—12周骨折全部骨性愈合,无延迟愈合。术后3个月参照Neer肩关节百分评分标准,优10例,良15例,可3例,差1例,优良率为86.2%(25/29)。结论经皮穿针和逆行髓内针固定治疗效果满意,并发症发生率低,是治疗肱骨近端骨折的理想办法。 相似文献
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颗粒松质骨压紧植骨全髋关节置换术治疗创伤性髋关节炎的疗效 总被引:2,自引:0,他引:2
目的探讨颗粒松质骨压紧植骨全髋关节置换术(THA)治疗髋臼骨折继发创伤性髋关节炎的疗效。方法1998年12月-2005年5月,对15例髋臼骨折继发创伤性髋关节炎患者行颗粒松质骨压紧植骨THA,所有患者髋臼假体均采用骨水泥固定,颗粒骨均取自体骨,术后24h后开始被动活动,3个月后开始全负重锻炼。临床随访采用Harris髋关节评分(HSS)系统评分,对任何原因引起髋臼假体翻修均视为临床失败。根据Conn等影像学评价法观察颗粒骨长人情况,根据DeLee的三区法测量臼杯、骨水泥与移植骨间的界面宽度,臼杯的移位程度则依据其相对于泪点间线的距离而定。结果14例患者获得平均4.3年(1.0-7.5年)随访,HHS评分由术前平均42分(10-62分)提高到随访结束时平均84分(58-98分)。1例髋部有轻度疼痛,无患者行翻修手术。大部分髋部恢复了其正常的旋转中心,仅有2例高出对侧0.8 mm。大多数患者影像学表现稳定,2例在Ⅰ区和Ⅲ区出现进行性增宽的透亮带,1例在Ⅲ区出现非进行性增宽的透亮带。1例臼杯假体在术后7年出现明显移位(6 mm),但并没有行翻修手术。结论颗粒骨压紧植骨技术作为一种生物学髋臼重建方法,其联合THA治疗髋臼骨折后继发创伤性关节炎伴髋臼缺损的疗效令人满意,能够恢复髋关节的正常解剖和功能活动。 相似文献