Construction of Sox9 gene eukaryotic expression vector and its inductive effects on directed differentiation of bone marrow stromal cells into precartilaginous stem cells in rats

Sox9 gene was cloned from immortalized precartilaginous stem cells and its eukaryotic expression vector constructed in order to explore the possibility of bone marrow-derived stromal cells differentiation into precartilaginous stem cells induced by Sox9. A full-length fragment of Sox9 was obtained by RT-PCR, inserted into pGEM-T Easy clone vector, and ligated with pEGFP-IRES2 expression vector by double digestion after sequencing. The compound plasmid was transfected into born marrow-derived stromal cells by Lipofectamine 2000, and the transfection efficacy and the expression of Sox9 and FGFR-3 were observed. Flow cytometry was used to identify the cell phenotype, and MTT was employed to assay proliferative viability of cells. Sequencing, restrictive endonuclease identification and RT-PCR confirmed that the expansion of Sox9 and construction of Sox9 expression vector were successful. After transfection of the recombinant vector into bone marrow-derived stromal cells, the expression of Sox9 and FGFR-3 was detected, and proliferative viability was not different from that of precartilaginous stem cells. It was concluded that Sox9 gene eukaryotic expression vector was successfully constructed, and the transfected bone marrow-derived stromal cells differentiated into the precartilaginous stem cells.     

大鼠骨骺干细胞免疫纯化和Sox9基因真核表达载体的克隆构建*★

目的：Sox9基因是一种重要的早期胚胎发育相关基因，是前软骨细胞浓聚所必需的因子，其促进成骨但同时可以抑制骨骺细胞的终末分化，以延长软骨发育成熟过程，延迟软骨发育，抑制软骨细胞凋亡，有利于骨骼在生长发育阶段形成复杂的形状和结构。从骨骺干骨细胞中克隆得Sox9基因，并构建其真核表达载体。 方法: 实验于2007-03/07在同济医学院矫形外科实验室完成。①实验材料：出生< 24 h纯系清洁级新生SD大白鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：参考游洪波等方法，采用免疫磁珠技术分离纯化具有FGFR-3特异性表面标志的大鼠骨骺干细胞，以FGFR-3抗体对骨骺干细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学鉴定。提取骨骺干细胞总RNA，以RT-PCR方法获得Sox9基因的全长，插入pGEM○R-T Easy Vector System克隆载体中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFP-IRE2构建重组复合质粒。 结果:免疫组织化学证实，显微取材分离并纯化的细胞为骨骺干细胞。从骨骺干细胞中提取的总RNA经电泳可得28 s、18 s和5 s共3条带，测吸光度值为0.263 5，A 260 / A 280为1.874 1，说明提取的总RNA完整性较好，纯度高，符合RT-PCR的要求。PCR产物经电泳可得到约2 000 bp的特异性条带，与预期大小一致。经限制性内切酶酶切图谱分析DNA序列测定证实的目的基因已经插入重组质粒，成功地构建了Sox9质粒。 结论：成功地分离纯化了骨骺干细胞，克隆出Sox9基因并构建了Sox9基因的真核表达载体，为进一步研究Sox9的生物学功能及其在成软骨和成骨分化过程中的作用奠定了基础。     

壳聚糖/纳米羟基磷灰石分层复合支架的生物相容性研究

制备壳聚糖/纳米羟基磷灰石(CS/nHA)分层复合支架,对其进行细胞毒性评价.分离培养大鼠软骨细胞接种于支架,相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附及生长情况.动物皮下埋植试验观察其组织相容性.实验结果证实壳聚糖/纳米羟基磷灰石分层复合支架具有良好的生物相容性,有望成为较好的骨软骨组织工程支架.     

微创内固定治疗老年骨盆脆性骨折

正随着人口老龄化的进展,老年人因行动不便容易跌倒,且常伴有骨量丢失~([1]),低暴力引起的老年骨盆脆性骨折发病率逐年上升~([2])。对于老年骨盆脆性骨折,保守治疗往往需要长期卧床,这就不可避免地增加了发生下肢深静脉血栓、坠积性肺炎、压疮等一系列严重并发症的风险~([2-5])。传统骨盆切开复位内固定手术治疗骨盆脆性骨折,需要对骨盆深层结构广泛暴露,对软组织损伤大、出血多、易损伤血管神经、手术时间长,体质较差或患有基础疾病的老年患者大多     

Sox9基因真核表达载体的构建及其诱导大鼠骨髓基质细胞定向分化为骨骺干细胞

[目的] 从永生化骨骺干细胞中克隆Sox9基因并构建真核表达载体,并探讨Sox9诱导骨髓基质细胞向骨骺干细胞分化的可能性.[方法]以RT-PCR方法获得Sox9全长,插入pGEM-T Easy克隆载体中,测序正确后与pEGFP-IRES2表达载体酶切后连接,复合质粒以脂质体法转染骨髓基质细胞,观察转染效率,Sox9和 FGFR-3的表达.流式细胞术鉴定细胞表型,MTT法检测细胞增殖活性.[结果]成功的完成了Sox9的扩增和表达载体的构建 ,重组载体转染骨髓基质细胞后能检测到Sox9、FGFR-3的表达,增殖活性与骨骺干细胞无异.[结论]成功构建了Sox9真核表达载体,其能诱导骨髓基质细胞分化为骨骺干细胞并具有其特性.     

大鼠骨骺干细胞免疫纯化和Sox9基因真核表达载体的克隆构建

目的:Sox9基因是一种重要的早期胚胎发育相关基因,是前软骨细胞浓聚所必需的因子,其促进成骨但同时可以抑制骨骺细胞的终末分化,以延长软骨发育成熟过程,延迟软骨发育,抑制软骨细胞凋亡,有利于骨骼在生长发育阶段形成复杂的形状和结构.从骨骺干骨细胞中克隆得Sox9基因,并构建其真核表达载体.方法:实验于2007-03/07在同济医学院矫形外科实验室完成.①实验材料:出生＜24h纯系清洁级新生SD大白鼠,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:参考游洪波等方法,采用免疫磁珠技术分离纯化具有FGFR-3特异性表面标志的大鼠骨骺干细胞,以FGFR-3抗体对骨骺干细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学鉴定.提取骨骺干细胞总RNA,以RT-PCR方法获得Sox9基因的全长,插入pGEM(R)-T Easy Vector System克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFP-IRE2构建重组复合质粒.结果:免疫组织化学证实,显微取材分离并纯化的细胞为骨骺干细胞.从骨骺干细胞中提取的总RNA经电泳可得28 s、18 s和5 s共3条带,测吸光度值为0.263 5,A 260/A 280为1.8741,说明提取的总RNA完整性较好,纯度高,符合RT-PCR的要求.PCR产物经电泳可得到约2000 bp的特异性条带,与预期大小一致.经限制性内切酶酶切图谱分析DNA序列测定证实的目的基因已经插入重组质粒,成功地构建了Sox9质粒.结论:成功地分离纯化了骨骺干细胞,克隆出Sox9基因并构建了Sox9基因的真核表达载体,为进一步研究Sox9的生物学功能及其在成软骨和成骨分化过程中的作用奠定了基础.     

新型国产髋关节假体用于人工髋关节置换的随机对照研究

目的 通过随机对照临床试验,评价一种新型国产髋关节假体用于人工全髋关节置换术(total hip arthroplasty,THA)的临床疗效和安全性.方法 本研究采用多中心、随机、单盲、阳性平行对照设计,在全国5家医院共招募72例受试者,分别纳入试验组和对照组,各36例.试验组使用新型国产髋关节假体,对照组使用成熟的...     

新型国产膝关节假体用于全膝关节置换术的临床研究

目的 通过随机对照临床试验,验证新型国产膝关节假体临床应用的安全性和有效性.方法 本研究采用多中心、随机、单盲、阳性平行对照设计,自2017年3月至2019年3月在全国6家医院共招募72例受试者,试验组和对照组各36例.试验组使用新型国产膝关节假体,对照组使用成熟的膝关节假体.所有受试者在术前和术后3个月、6个月、1年...     

MIPPO技术与改良Stoppa入路治疗骨盆前环骨折的疗效对比

目的 比较MIPPO技术与改良Stoppa入路固定骨盆前环骨折的临床效果。方法 回顾性分析华中科技大学同济医学院附属同济医院2016年9月至2019年10月行手术治疗的34例骨盆前环骨折患者的临床资料,分为MIPPO技术组（20例）及改良Stoppa入路组（14例）。比较两组的手术时间、术中出血量、切口长度、ASA评分、术中透视次数、术后炎性指标（D-D二聚体定量、降钙素原、超敏C反应蛋白、血沉、白细胞计数、中性粒细胞计数）、术后住院时长、下地时间、骨折愈合时间、完全负重时间及并发症发生率,采用Matta评分及Majeed评分评估骨盆骨折术后恢复情况。结果 两组患者平均随访时间为（30.24±9.39）个月（20 ～ 60个月）。MIPPO技术组的手术时间、术中出血量、切口长度及术中透视次数均低于改良Stoppa入路组（P＜0.05）;术后MIPPO技术组炎性指标（D-D二聚体定量、血沉、中性粒细胞）、术后住院时长及下地时间低于或早于改良Stoppa入路组（P＜0.05）;两组之间ASA评分、降钙素原、超敏C反应蛋白、白细胞计数、骨折愈合时间、完全负重时间、Matta评分等级、Majeed评分及等级,以及并发症发生率差异比较,无统计学意义（P＞0.05）。术后7 d内复查骨盆正位X线,MIPPO技术组及改良Stoppa入路组的Matta评分优良率分别为95.00%、85.71%。末次随访时,MIPPO技术组及改良Stoppa入路组的Majeed评分优良率分别为90.00%、78.57%。结论 MIPPO技术治疗骨盆前环骨折可获得满意效果,与改良Stoppa术式相比,具有手术时间短、术中出血量少、手术切口小及术后下地早等优势,值得推广。     

siRNA抑制骨肉瘤U2OS细胞系中SIRT6的表达及其生物学作用研究

背景与目的：sirtuin6(SIRT6)蛋白是对人体细胞生长、代谢调控及应激反应等具有重要作用的一种核蛋白,常在细胞核中发挥多种调控作用。但该蛋白在骨肉瘤中的作用还不清楚,本研究通过下调人骨肉瘤U2OS细胞系中SIRT6的表达,观察其对U2OS细胞的作用。方法：设计合成SIRT6的siRNA序列,通过Lipofectamine^TM2000转染U2OS细胞系,通过蛋白质印迹法（Western blot）检测SIRT6蛋白的表达情况,利用流式细胞术检测细胞凋亡,细胞计数试剂盒（cellcounting kit-8,CCK-8）法检测细胞增殖,Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力,CCK-8法分析对紫杉醇的敏感性。结果：成功构建SIRT6 siRNA序列,Western blot检测转染后24、48和72 h的蛋白水平,实验组较对照组明显降低。流式细胞术检测细胞凋亡也显示实验组凋亡增加（P＜0.05）。Transwell法检测结果显示,实验组侵袭与迁移能力较对照组下降（P＜0.05）。CCK-8法检测细胞生长情况,可见经紫杉醇处理后实验组生长较对照组下降明显,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：下调骨肉瘤U2OS细胞中SIRT6的表达可以抑制骨肉瘤细胞侵袭,促进凋亡,并增强骨肉瘤细胞对紫杉醇的化疗敏感性。