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目的 探讨用一条Link序列T2A连接骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因构建含目的 基因的腺病毒载体的可行性.方法 先从cDNA中扩增得到全长BMP-2和bFGF基因片段,再接于Link序列T2A的两端.通过T2A Peptide的互补.延伸得到BMP2-T2A-bFGF的全长PCR产物,利用上游引物的Bgl Ⅱ酶切位点和下游引物的EeoRV酶切位点将其插入到pShuttle-IRES载体中,酶切、测序鉴定;利用同源重组技术将目的 基因表达框从穿梭质粒转移到腺病毒载体,鉴定阳性克隆;将PacI线性化后的腺病毒载体转染到293A细胞,观察GFP表达,PCR鉴定后进行大量扩增,并用CsCl梯度离心法进行纯化;测量A260,计算病毒感染滴度.结果 克隆得到的BMP-2与bFGF基因测序正确.经BglⅡ和EeoR Ⅴ双酶切得到的BMP2-bFGF 2个基因全长序列完全克隆到穿梭质粒和重组腺病毒载体质粒中;转染293A细胞2周后观察到明显的GFP聚集表达,即病毒包装成功,扩增纯化后滴度为3.6×1011 VP/ml.结论 经酶切鉴定BMP-2与bFGF双基因共表达腺病毒载体构建成功.  相似文献   
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目的 探讨腺病毒介导骨形态发生蛋白2(BMP2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)双基因体外转染山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)后目的基因表达与诱导成骨情况. 方法 从2岁健康雌性山羊髂骨处骨穿抽取骨髓2ml,利用密度梯度离心法分离培养山羊BMSCs,将前期构建好的腺病毒载体Ad-BMP2-bFGF、Ad-BMP2分2组,以MOI=5000分别转染BMSCs,每2d用ELISA法检测BMP2和bFGF的表达情况,每周用ALP染色试剂盒及定量试剂盒检测ALP表达情况. 结果 Ad-BMP2-bFGF转染BMSCs 48 h后,目的蛋白已有显著表达(BMP2为3996.22 pg/ml、bFGF为1352.15 pg/ml),第6天达到高峰(BMP2为5146.63 pg/ml、bFGF为1434.75pg/ml),与未转染组比较差异有统计学意义(P<0.05),3周后细胞呈现明显的成骨改变,ALP活性明显增高(266mol/L),Ad-BMP2-bFGF组ALP表达量约为Ad-BMP 2组的1.5倍(P<0.05). 结论 经Ad-BMP2-bFGF转染的BMSCs具有持续高水平目的蛋白表达活性,转染后的BMSCs表现出明显的成骨活性,成骨活性明显强于Ad-BMP2组.  相似文献   
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目的 探讨经皮侧路孔镜下靶点穿刺置管治疗重度脱垂型腰椎间盘突出症(highly migrated lumbar disc herniation, HMLDH)的可行性。方法 2015年5月~2019年12月,我院收治HMLDH 38例,其中向上重度脱垂型10例,向下重度脱垂型28例;突出节段L3-4 6例,L4-5 32例。采用经皮侧路椎间孔镜下靶点穿刺置管,直视下摘除脱垂的髓核。结果 手术时间45~180 min、平均90 min,无手术相关并发症。38例随访12~42个月,术前1 d、术后1 d和末次随访时的腰腿痛VAS分别为(7.6±2.1)分、(1.5±1.3)分、(1.4±0.8)分,ODI指数分别为(20.2±7.5)%、(9.5±4.0)%、(6.3±2.4)%。根据MacNab标准,术后第1天优33例、良5例;最后一次随访时,优36例、良2例。结论 经皮侧路孔镜下靶点穿刺技术治疗HMLDH是一种安全、有效、可行的手术方法。  相似文献   
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