活体成年小鼠舌黏膜下植入蛋白凝胶颗粒的方法学研究

目的：建立活体动物舌黏膜植入外源性蛋白凝胶颗粒的方法。方法：出生后90.5d的C57BL小鼠经戊巴比妥钠麻醉后,于舌黏膜下植入小牛血清（bovineserum albumin,BSA）的凝胶颗粒。实验后48h,取小鼠舌组织固定、脱水、包埋、切片后进行HE染色、Brdu染色及PCNA染色。结果：实验后48h,小鼠舌黏膜无明显炎性病变,染色结果显示凝胶颗粒的植入对上皮内BrdU和PCNA的表达无影响。结论：本研究成功地建立了舌黏膜下植入蛋白凝胶颗粒的方法,为将来药物和蛋白质诱导活体动物器官局部增殖、分化和凋亡奠定基础。     

凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠T淋巴细胞增殖及活性的影响

目的 探讨凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠T淋巴细胞增殖及活性的影响.方法 (1)取对数生长期大肠癌CT26细胞制备凋亡肿瘤细胞及坏死肿瘤细胞,取Balb/c小鼠脾脏分离T淋巴细胞,并制备细胞毒性T淋巴细胞(CTL).(2)将凋亡肿瘤细胞、坏死肿瘤细胞、正常肿瘤细胞分别与小鼠CTL共同培养(分别为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组),测定CTL的活性及增殖情况.(3)将小鼠T淋巴细胞分为对照组、刀豆蛋白A(ConA)组、凋亡肿瘤细胞+ ConA组、坏死肿瘤细胞+ConA组、活肿瘤细胞+ConA组,经相应处理后测定各组T淋巴细胞的活性及增殖情况.(4)选取30只Balb/c小鼠分为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组各10只,分别将凋亡、坏死、对数生长期CT26细胞通过皮下及静脉输注小鼠,检测各组小鼠血清调节性T细胞(Treg)的表达情况.(5)另取30只小鼠,按方法(4)分组及处理后,测定各组小鼠血清可溶性Fas(sFas)、白细胞介素(IL)-12、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-4、IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平.结果 凋亡肿瘤细胞组中CTL的活性、A450值均低于其他两组(P＜0.05).凋亡肿瘤细胞+ ConA组的T淋巴细胞CD69、CD25、CD71的表达率以及G2、G3及G4期的T淋巴细胞数量均低于ConA组、活肿瘤细胞+ ConA及坏死肿瘤细胞+ConA(P ＜0.05).凋亡肿瘤细胞组Treg的表达水平、sFas相对表达量低于肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组(P＜0.05).凋亡肿瘤细胞组IL-10、TGF-β表达水平高于其他两组(P＜0.05),而IL-12表达水平均低于其他两组(P＜0.05),IL4表达水平则高于肿瘤细胞对照组(P＜0.05).结论 凋亡小鼠大肠癌CT26细胞能够抑制小鼠T淋巴细胞增殖及活性,影响大肠癌小鼠正常免疫功能.     

Gsdermin A3基因在小鼠皮肤角质形成细胞中对Krt6b基因表达的影响

目的 初步探讨Gsdermin A3(Gsdma3)基因对Krt6b基因表达的影响.方法 通过组织切片的免疫荧光观察、RT-PCR、Q-PCR、Western blot等方法检测毛囊生长期[出生后8 d(P8d)]、毛囊退化期(P16d)、毛囊静止期(P25d)的Gsdma3基因突变鼠(AE鼠)和野生型鼠(WT鼠)背部皮肤Krt6b基因的表达情况.利用免疫荧光进一步观察注射有Gsdma3和RFP腺病毒的Gsdma3基因突变鼠和野生型鼠的Krt6b基因的表达情况.结果 Gsdma3基因突变鼠的Krt6b基因表达量在各个时相点均高于野生型鼠(P＜0.05).其中,在出生后16 dKrt6b基因表达量达到最高,而在出生后25 d降至最低.对Gsdma3基因突变鼠进行基因回补后,免疫荧光、实时定量PCR及Western blot检测结果显示Krt6b基因表达减弱.同时,对野生型鼠过表达Gsdma3基因后,免疫荧光、实时定量PCR及Western blot结果显示Krt6b基因表达量降低.结论 小鼠皮肤角质形成细胞中,Krt6b基因的表达受Gsdma3基因抑制.     

缺氧诱导因子-1α小干扰RNA对人膀胱癌小鼠移植瘤生长的实验研究

目的 观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)siRNA对人膀胱癌小鼠膀胱原位移植瘤生长的抑制作用,探讨HIF-1α作为膀胱癌基因治疗靶点的有效性.方法 把已稳定转染pGC-siHIF-1α的人膀胱癌细胞株T24接种至小鼠膀胱.通过CT观察肿瘤生长,应用免疫组化(SABC)检测肿瘤细胞HIF-1α和肿瘤间质CD34的水平,根据CD34表达情况评价肿瘤微血管密度(MVD).末端脱氧核苷酸转移酶标注法(TUNEL)测定肿瘤细胞凋亡指数;二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法测定肿瘤细胞增值率;流式细胞仪(FCM)测定肿瘤细胞周期分布.结果 实验组与对照组相比较,实验组成瘤率低,肿瘤生长速度缓慢(p＜0.05);HIF-1α水平下降(P＜0.01);肿瘤微血管密度减少(P＜0.01);凋亡指数升高(P＜0.01);增殖能力减弱(P＜0.01);G0/GI期细胞增多,G2/M期和S期细胞均减少(P＜0.05);与对照组相比较,组间差异均具有统计学意义.结论 以HIF-1α为靶点的siRNA有抑制H1F-1α表达,遏制膀胱癌T24细胞在体内生长的作用,HIF-1 0有可能成为临床膀胱癌基因治疗的新的有效靶点.     

抗巨噬细胞移动抑制因子单抗对溃疡性结肠炎小鼠治疗效果及炎症因子水平的影响

目的 探讨抗巨噬细胞移动抑制因子(MIF)单抗对溃疡性结肠炎(UC)小鼠治疗效果及炎症因子水平的影响.方法 选取30只雄性BALB/c小鼠,分为正常对照组、UC模型组、抗MIF单抗组各10只,以5％葡聚糖硫酸钠诱导建立小鼠UC模型,建模后抗MIF单抗组采用抗MIF单抗腹腔注射给药.给药期间观察各组小鼠一般情况并进行疾病活动指数(DAI)评分、大肠大体损伤评分及组织学评分.建模后第8天检测血清MIF、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)浓度.结果 与正常对照组比较,UC模型组及抗MIF单抗组小鼠DAI评分、大肠大体损伤评分及组织学评分均明显增高(P＜0.05);与UC模型组比较,抗MIF单抗组DAI评分、大肠大体损伤评分及组织学评分均明显下降(P＜0.05);与正常对照组相比,UC模型组及抗MIF单抗组MIF、TNF-α和IL-6浓度显著升高(P＜0.05);与UC模型组相比,抗MIF单抗组MIF、TNF-α和IL-6浓度降低(P＜0.05).结论 抗MIF单抗能有效地抑制UC小鼠血清炎症因子的水平,对UC的治疗有一定的效果.     

MHV-3诱导的暴发性肝炎小鼠肝脏和慢加急性肝衰竭患者外周血单个核细胞 TLR2表达的变化

目的：研究慢性乙型肝炎患者和慢加急性乙型肝炎肝衰竭（HBV-ACLF）患者外周血单个核细胞（PBMC）Toll 样受体2（TLR2）表达，以及鼠三型肝炎病毒（MHV-3）诱导的暴发性肝炎小鼠肝脏 TLR2表达的变化。方法收集慢性乙型肝炎和 HBV-ACLF 患者外周血，分离 PBMC，采用实时定量 PCR 法检测 PBMC 中 TLR2 mRNA；给 Balb/cJ 小鼠腹腔注射MHV-3（100 pfu），建立小鼠暴发性肝炎模型，观察感染0、24、48和72 h 后肝脏TLR2水平变化。结果 BALB/cJ 小鼠在感染 MHV-3后，与0 h[（0.39±0.06）%]比，肝细胞 TLR2 mRNA 水平在感染48和72 h 均显著升高[分别为（9.06±1.60）%和（6.42±2.42）%，P＜0.05）]，并于48 h 达最高水平，且两时间点细胞 TLR2 mRNA 水平均与血清 ALT 和 AST 水平呈正相关（r=0.804，P＜0.01；r=0.797，P＜0.01）；HBV-ACLF患者 PBMC 中 TLR2 mRNA 水平显著高于慢性乙型肝炎患者[（5.92±5.26）%对（1.15±1.59）%，P＜0.05）]。结论 TLR2参与了 MHV-3诱导的暴发性肝炎小鼠以及 HBV-ACLF 患者肝脏损伤的发病过程。     

Alpha-黑素细胞刺激素及其新型类似物对小鼠脑微血管内皮细胞产生组织因子的抑制作用

目的研究Alpha-黑素细胞刺激素(α-MSH)及其新型类似物(STY39)对原代小鼠脑微血管内皮细胞(MBMEC)在脂多糖(LPS)刺激下产生组织因子(TF)和组织因子途径抑制物(TFPI)的影响。方法选用雌性BALB/c小鼠,纯化并原代培养MBMEC,培养至5~7d,采用免疫荧光法检测Ⅷ因子相关抗原,鉴定MBMEC模型。将MBMEC分为PBS对照组,LPS刺激组,LPS刺激后1、2、3 h加入10-7mol/L的α-MSH或STY39组(LPS+α-MSH,LPS+STY39),共8组,每组4孔。分别在LPS刺激后6h和8h收集细胞培养上清液和细胞,应用酶联免疫吸附法检测细胞上清液的TF和TFPI浓度,RT-PCR检测细胞TF mRNA表达水平。结果 (1)LPS可诱导MBMEC产生TF和TFPI蛋白,细胞培养上清液中TF水平于6 h达到高峰,TFPI水平于8 h达到高峰。(2)LPS刺激MBMEC后1、2、3 h给予10-7mol/L的α-MSH或STY39,均可显著降低细胞上清液中TF蛋白含量(P0.01),尤其在LPS刺激后1 h给予α-MSH或STY39的效果最显著(P0.05),STY39降低TF含量的作用较α-MSH明显(P0.05);但α-MSH和STY39对LPS诱导MBMEC产生TFPI均没有显著的上调作用。(3)在LPS刺激后不同时间点给予10-7mol/L的α-MSH或STY39,均可显著下调MBMEC TF mRNA的表达水平(P0.01),其中1 h时间点作用最显著(P0.05),但α-MSH与STY39的作用差异无统计学意义。结论α-MSH和STY39均能抑制LPS诱导原代MBMEC产生TF蛋白和表达TF mRNA,且LPS刺激1 h后给药效果较好;STY39对MBMEC产生TF蛋白的抑制作用优于α-MSH。     

CpG ODN对哮喘小鼠肺组织FcεRⅠ、FcγRⅡb表达的影响

目的观察CpGODN对哮喘小鼠肺组织FcaRI、FcTRIIb表达的影响，探讨其诱导免疫耐受的相关机制。方法将48只清洁级雄性Balb／c小鼠随机分为正常对照组（A组）、哮喘组（B组）、地塞米松（DXM）治疗组（C组）、CpGODN治疗组（D组），每组12只。以卵白蛋白（OVA）作用建立小鼠哮喘模型。收集支气管肺泡灌洗液（bronchialalveolarlavagefluid，BALF）计数细胞总数并分类，取肺组织作病理，反转录一聚合酶链反应（RT—PCR）法测定肺组织中FcεRⅠ、FcγRⅡbmRNA的表达。结果（1）电镜观察肺组织超微结构：B组显示支气管及血管周围有较多炎性细胞浸润，肺泡隔内嗜酸粒细胞浸润，c组和D组与B组相比明显减轻。（2）BALF中炎症细胞表达变化：与B组相比，C组、D组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞（eosino—phil，EOS）绝对值以及EOS占细胞总数的百分比（EOS％）均显著减少（P〈0．01）。（3）RT—PCR结果：C组、D组FcεRⅠ mR—NA表达均显著低于B组（P〈0．01），C组、D组FcγRⅡb mRNA表达均显著高于B组（P〈0．01）。（4）相关分析：小鼠肺组织FcεRⅠ和FcγRⅡb表达呈显著负相关（P〈0．01，n=40）。结论CpGODN能降低哮喘小鼠肺组织FcεRⅠ的表达，增加FcγRⅡb的表达，具有改善气道炎症和诱导免疫耐受的作用。     

黄连素对癌性恶病质小鼠肝肾功能的影响

目的 检测癌性恶病质小鼠肝、肾功能及细胞凋亡情况,探讨黄连素对癌性恶病质小鼠脏器功能的影响.方法 使用小白鼠结肠腺癌细胞株CT-26皮下注射Balb/c小白鼠,构建荷瘤小白鼠肿瘤恶病质模型,将小白鼠分为3组：正常对照组、荷瘤无干预组、荷瘤黄连素干预组,连续2周记录小白鼠饮食量、饮水量、体质量,并检测各组小鼠肝肾功能、肝肾组织形态、肝肾细胞凋亡情况.结果 与荷瘤无干预组比较,黄连素能明显抑制癌性恶病质小鼠的体重下降,增加摄食量、饮水量,改善小鼠的一般状况;减轻肝肾病理损害程度,减少肝肾组织细胞凋亡,改善恶病质小鼠肝肾功能（P＜0.05）.结论 黄连素可改善癌性恶病质小鼠肝肾功能,减轻肝肾细胞凋亡程度.