应用同源重组技术构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型打靶载体的策略

目的构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型基因敲入打靶载体,模仿低血钾周期性麻痹患者中的对应发现。方法采用置换型载体,分为长短、短臂设计（1.5～2.0kb）,以便用聚合酶链反应（PCR）方法筛选中靶载体和ES细胞（embrgonic stem cell）。首先以Cchl1a3基因为模板设计引物,并引入与质粒内插入位点酶切序列相配的内切酶序列,扩增用于套取的同源臂a和b,以及用于插入筛选基因和实行定点突变的同源臂c和d,c和d首尾相接,用点突变特异性PCR在c内实现R528H突变。将a和b定向插入pBR322,借助于温度敏感的pSC101-BAD-gba-（tet）质粒的表达Red/ET重组酶,使其与携带Cchl1a3基因的细菌人工染色体（BAC）实现同源重组,套取含目的突变点、长约8kb的Cchl1a3的基因片断,形成pBR322-Cchl1a3。将c和d定向插入PL451质粒Frt-Neo-Frt片段两侧,酶切c-Frt-Neo-Frt-d片断纯化后,再与pBR322-Cchl1a3质粒一同转入含Red/ET重组酶基因的大肠杆菌EL250菌株,在重组酶的催化下再次实现同源重组,在Cchl1a3基因的给定位点实现R528H突变并插入包含筛选基因和重组酶识别位点的Frt-Neo-Frt片断,完成载体的构建。载体构建过程中,酶切位点变化导致的片断程度改变作为初筛,PCR产物测序结果作为最后的鉴定依据。结果打靶载体符合设计要求。结论运用点突变特异性PCR,结合Red/ET重组技术构建基因定点突变的基因敲入型打靶载体,在重组酶催化下仅需要2次同源重组即可完成。该策略成熟简便,省时省力,构建的载体易于鉴定。     

一管酒精法提取转基因小鼠胚胎组织基因组的实验方法及应用

目的：优化提取基因组的方法，建立高效、简便、快速提取基因组DNA的方法，用于大批量转基因小鼠鉴定。方法：用一管酒精基因组DNA抽提法抽提基因组DNA。结果：经过分光光度法检测基因组DNA浓度、纯度及电泳分析DNA质量，显示一管酒精抽提法提取的基因组与经典酚氯仿提取法提取的基因组产量、纯度及质量没有明显差别；酶切全基因组后，2种方法获得的基因组都可以被酶完全切开；两者模板都能成功应用PCR扩增来鉴定基因敲入小鼠并可应用于基因组测序及Real-time PCR检测基因敲入小鼠中外源基因并鉴定其相对拷贝数。结论：一管酒精基因组抽提法得到的DNA质量可靠，可高效、简便、快速鉴定转基因小鼠及进行基因组DNA酶切、测序、Real-time PCR等后续实验。     

低密度脂蛋白受体相关蛋白5在骨中发挥调节骨量的作用

人类骨骼受低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low-density lipoprotein receptor-related protein 5,LRP5)的影响。有研究发现,骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(osteoporosis-pseudoglioma syndrome)的个体携带功能缺失的Lrp5基因突变,而Lrp5基因的杂合子错义突变则在显性遗传的骨量增多(high bone mass,HBM)个体中被发现。为探讨Lrp5如何影响骨性质,Cui等繁育了一系列Lrp5基因敲入(knock-in)或敲除(knockout)小鼠,结果发现:(1)遗传性敲入致HBM的Lrp5等位基因使小鼠骨量增多。(2)在骨细胞中敲入致HBM的Lrp5等位基因也同样能增加骨量。(3)在     

非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白2靶蛋白C'末端SBP-3×Flag标记的HCT 116结直肠癌细胞模型的建立

目的建立非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白2靶蛋白(TPX2)C'末端SBP-3×Flag标记的HCT116结直肠癌细胞模型。方法 PCR扩增同源臂,构建TPX2的腺相关病毒打靶载体,包装病毒后打靶HCT116结直肠癌细胞,G418和PCR筛选获得含有新霉素抗性基因的阳性细胞株,最后通过Cre病毒感染去除抗性基因,并用PCR方法筛选获得TPX2C末端SBP和3×Flag内源性双标签的HCT116结直肠癌细胞株。结果筛选获得2个含有新霉素抗性基因的细胞株,随后经Cre病毒感染得到去除新霉素抗性基因的阳性细胞克隆,并经Western blot检测验证了SBP-3×Flag基因的敲入。结论成功建立了TPX2 C'末端SBP-3×Flag标记的HCT116结直肠癌细胞模型。     

应用改良体细胞基因敲入技术内源标记跨膜丝氨酸蛋白酶RHBDDl的研究

目的应用改良的体细胞基因敲入技术将标签序列靶向敲人目的基因。方法设计引物并构建RHBDDI的打靶载体，经过腺相关病毒包装、感染、新霉素筛选和鉴定等步骤获得含有新霉素抗性的阳性单克隆细胞株，最后通过ere病毒感染和筛选获得RHBDDI内源敲人FLAG和SBP双标签的HCTI16结直肠癌细胞株。结果经过包装病毒感染与筛选验证后得到6个打靶阳性克隆；进一步经ere病毒感染与筛选后得到2株去除新霉素抗性标记的阳性细胞克隆；通过Western blotting实验证明RHBDDl-FLAG-SBP融合蛋白的表达。结论通过改良的体细胞基因敲入技术成功构建跨膜丝氨酸蛋白酶RHBDDl内源敲入FLAG和SBP双标签的HCTll6结直肠癌细胞株。     

应用改良体细胞基因敲入技术内源标记跨膜丝氨酸蛋白酶RHBDD1的研究

目的应用改良的体细胞基因敲入技术将标签序列靶向敲入目的基因。方法设计引物并构建RHBDD1的打靶载体,经过腺相关病毒包装、感染、新霉素筛选和鉴定等步骤获得含有新霉素抗性的阳性单克隆细胞株,最后通过cre病毒感染和筛选获得RHBDD1内源敲入FLAG和SBP双标签的HCT116结直肠癌细胞株。结果经过包装病毒感染与筛选验证后得到6个打靶阳性克隆;进一步经cre病毒感染与筛选后得到2株去除新霉素抗性标记的阳性细胞克隆;通过Western blotting实验证明RHBDD1-FLAG-SBP融合蛋白的表达。结论通过改良的体细胞基因敲入技术成功构建跨膜丝氨酸蛋白酶RHBDD1内源敲入FLAG和SBP双标签的HCT116结直肠癌细胞株。     

GAD67-GFP基因敲入小鼠5-羟色胺与γ-氨基丁酸共存神经元在脑内的分布

目的:采用免疫荧光组织染色方法,以GAD67-GFP基因敲入小鼠为实验动物,系统地观察了小鼠脑干内5-羟色胺(5-HT)与γ-氨基丁酸(GABA)的共存情况,为中枢神经系统内5-HT与GABA共存神经元的分布提供形态学证据.方法:应用免疫荧光组织染色技术,对GAD67-GFP基因敲入小鼠脑干内5-HT与GABA免疫荧光双重染色,观察双重标记神经元在5-HT细胞群(B1-B9)中的分布情况并计数.结果:在所有脑干的5-HT细胞群中,双重标记神经元在中缝大核区域内所占的比率最高,平均为10.0%,其次是中缝苍白核和中缝隐核,分别为1.8%和1.4%.中缝桥核与中缝背核所含的共存神经元比例小,仅0.9%和0.3%.而在其他细胞群即B4,B6和B8-9细胞组,未观察到双重标记神经元.结论:在中枢神经系统内,只有部分延髓中线核团的5-HT能神经元同时含有GABA,而中脑中线核团和脑干的其他非中线5-HT细胞群内未见这种共存神经元的存在.     

CRISPR-Cas9——RNA介导的基因组编辑技术研究进展

成簇规律间隔短回文重复RNA-CRISPR相关蛋白质9系统(clustered regularly interspersed short palindromic repeat RNA/CRISPR-associated 9,CRISPR-Cas9)来源于Ⅱ型CRISPR-Cas系统,在自然条件下为细菌抵抗噬菌体侵袭的获得性免疫防御系统.改造后的CRISPR-Cas9系统可作为基因组编辑的有效工具,是最具前景的新一代基因修饰策略.CRISPR-Cas9系统不仅能对基因组进行单个位点的特异性识别,还可同时对基因组的多个位点进行修饰,实现对基因组的编辑如基因敲除、基因敲入的功能.目前,CRISPR-Cas9技术已在斑马鱼、哺乳动物细胞和小鼠动物模型中,通过可编程RNA实现了基因的精确修饰.可以预见,CRISPR-Cas9技术将在基础医学和临床医学领域发挥重要的作用.     

一管酒精法提取转基因小鼠胚胎组织基因组的实验方法及应用

目的:优化提取基因组的方法,建立高效、简便、快速提取基因组DNA的方法,用于大批量转基因小鼠鉴定。方法:用一管酒精基因组DNA抽提法抽提基因组DNA。结果:经过分光光度法检测基因组DNA浓度、纯度及电泳分析DNA质量,显示一管酒精抽提法提取的基因组与经典酚/氯仿提取法提取的基因组产量、纯度及质量没有明显差别;酶切全基因组后,2种方法获得的基因组都可以被酶完全切开;两者模板都能成功应用PCR扩增来鉴定基因敲入小鼠并可应用于基因组测序及Real-time PCR检测基因敲入小鼠中外源基因并鉴定其相对拷贝数。结论:一管酒精基因组抽提法得到的DNA质量可靠,可高效、简便、快速鉴定转基因小鼠及进行基因组DNA酶切、测序、Real-time PCR等后续实验。     

低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的构建

目的构建低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型。方法将Cchl1a3-knock-in打靶载体电转染ES细胞,经过G418和Ganciclovoir筛选阳性ES细胞克隆并用PCR和DNA测序法鉴定。将阳性ES克隆注射到小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。通过杂交获得的杂合子小鼠与FLP小鼠交配繁育获得去neo杂合子小鼠,并用PCR和DNA测序进行鉴定。将去neo杂合子小鼠交配得到纯合子后代,进行生长发育等方面的观察。结果打靶载体成功转染ES细胞,PCR和DNA测序法证实9个ES细胞克隆发生正确的同源重组。通过显微注射获得7只嵌合体小鼠。将嵌合体小鼠交配繁育的杂合子小鼠和FLP小鼠交配获得9只去neo杂合子小鼠,最终得到15只去neo纯合子小鼠。该小鼠在发育至性成熟阶段,精神、饮食及活动状态良好,但是在4个月龄时逐渐出现脱毛,皮肤破溃甚至死亡。结论成功构建Cchl1a3基因R528H突变的纯合子小鼠,为研究人类CACNA1S基因功能和阐明低钾型周期性麻痹发生的分子机制奠定了基础。