白血病患者异基因造血干细胞移植后T细胞免疫重建的研究

目的 通过分析TCR Vβ基因片段选择性扩增，了解白血病患者异基因外周血干细胞移植后T淋巴细胞的免疫重建及其在移植物抗宿主病(GVHD)患者中的表达特点．方法 采用RT—PCR扩增10例移植后患者外周血的单个核细胞的TCR Vβ24个基因片段，分析其TCR Vβ基因的表达情况，GVHD患者的PCR产物进一步经基因扫描分析确定T细胞克隆性．结果 经24个Vβ引物所分别进行的RT—PCR检测TCR Vβ各亚家族基因的表达情况，发现10例病人外周血与正常人表达24个Vβ亚家族有明显的不同，病人的部分Vβ亚家族T细胞仍未能重建，仅表达5-22个亚家族基因；9例GVHD患者外周血仅表达2—8个TCR Vβ亚细胞生长．结论 移植后病人外周血淋巴细胞TCR Vβ基因片段部分受抑制，部分基因片段呈选择性扩增．GVHD患者有Vβ3和Vβ8基因的优势表达，并有克隆性T细胞生成．     

白血病患者异基因造血干细胞移植后T细胞免疫重建的研究

目的通过分析TCR Vβ基因片段选择性扩增,了解白血病患者异基因外周血干细胞移植后T淋巴细胞的免疫重建及其在移植物抗宿主病(GVHD)患者中的表达特点.方法采用RT-PCR扩增10例移植后患者外周血的单个核细胞的TCR Vβ 24个基因片段,分析其TCR Vβ基因的表达情况,GVHD患者的PCR产物进一步经基因扫描分析确定T细胞克隆性.结果经24个Vβ引物所分别进行的RT-PCR检测TCR Vβ各亚家族基因的表达情况,发现 10例病人外周血与正常人表达24个Vβ亚家族有明显的不同,病人的部分Vβ亚家族T细胞仍未能重建,仅表达5～22个亚家族基因;9例GVHD患者外周血仅表达2～8个TCR Vβ亚家族,其中7例均表达Vβ3.对6例GVHD患者的基因扫描显示,均存在克隆性T细胞生长.结论移植后病人外周血淋巴细胞TCR Vβ基因片段部分受抑制,部分基因片段呈选择性扩增.GVHD患者有Vβ3和Vβ8基因的优势表达,并有克隆性T细胞生成.     

BHA通过ERK信号转导途径促进小鼠胎肝细胞神经组织细胞特异基因表达的研究

目的：了解丁羟回香醚（BHA）对小鼠胎肝（FL）细胞神经组织特异基因表达的影响及其信号途径。 方法： 采用MACS试剂盒分离小鼠胚胎肝Sca-1+细胞，以DMEM+10%胎牛血清培养液培养；第4 d后，加入或者不加入细胞外信号调节蛋白激酶特异抑制剂PD98059 (25 μmol/L)处理24 h，再加入BHA处理24 h（0.2 mmol/L）。然后在无血清培养基中培养5 d。用Western blotting和半定量RT-PCR方法分析BHA处理前后基因表达。 结果： 经BHA诱导处理后，细胞表达神经组织细胞特异蛋白显著增加如神经丝轻链（NF-L）、神经丝重链（NF-H）、脑因子1（BF-1）和酪氨酸羟化酶（TH）。NF-L、NF-H、BF-1和TH分别增加6.32倍、2.73倍、3.37倍、2.68倍。而PD98059能明显抑制BHA诱导的神经组织细胞特异蛋白NF-L、NF-H、BF-1和TH的表达。 结论： BHA通过细胞外信号调节蛋白激酶途径促进小鼠FL Sca-1+细胞表达神经组织细胞特异抗原、结构和功能基因。     

CML患者CD4+和CD8+T细胞的TCR Vβ基因谱系和克隆性分析

目的：了解慢性粒细胞白血病慢性期（CML-CP）患者外周血CD4^＋和CD8^＋T细胞中TCR Vβ亚家族T细胞的基因表达和克隆性.方法：利用RT-PCR分别扩增19例CML-CP患者外周血单个核细胞（PBMCs）、CD4^＋和CD8^＋细胞TCR Vβ亚家族基因的CDR3,阳性产物进一步经基因扫描分析其克隆性.结果：CML患者外周血CD4^＋和CD8^＋细胞分别表达部分（1～21个）Vβ亚家族,均以Vβ13的表达率最高,其次为Vβ9,多数患者的一些Vβ亚家族T细胞呈克隆性增殖,主要出现于CD8^＋细胞中,分别以Vβ21（CD4^＋）和Vβ11（CD8^＋）亚家族的克隆性增殖多见.结论：CML患者外周血CD4^＋和CD8^＋细胞的TCR Vβ谱系均存在限制性分布,患者存在的克隆性增殖CD4^＋和CD8^＋T细胞可能与宿主抗CML抗原反应有关,它们可能在抗CML效应中起主要作用.     

非何杰金淋巴瘤p15基因操纵区5’-CpG岛的甲基化的研究

目的：探索p15基因异常甲基化在非何杰金淋巴瘤(NHL)中的变化及其在各分型中的表达。 方法：用特异PCR（MSP）的方法检测32例非何杰金淋巴瘤石蜡标本p15基因甲基化；检测非何杰金淋巴瘤患者标本21例，用RT-PCR方法测定p15基因的表达。 结果:非何杰金淋巴瘤p15基因操纵区甲基化的发生率为18.9%（10/53），高度恶性比低度恶性更易发生甲基化，其发生率分别为27.3%和0%。 结论:p15基因甲基化可能是非何杰金淋巴瘤发病的原因之一，并与病程进展有关。     

超抗原SEA联合PML-RARα对外周血T细胞TCR Vβ亚家族基因表达的影响

目的探讨超抗原SEA联合PML-RARα多肽对外周血T细胞TCR邯亚家族基因表达的影响。方法分别将SEA、PML-RARα多肽以及SEA联合PML-RARα多肽与正常人外周血单个核细胞共同培养，20d后收集增殖细胞，利用RT-PCR及基因扫描技术分析诱导后增殖T细胞TCR Vβ亚家族的利用和克隆性增殖的特点。结果单纯SEA诱导后，T细胞表达了11个TCR Vβ亚家族，且仍为多克隆增殖。单纯PML-RARα多肽诱导后，T细胞限制性表达8个Vβ亚家族，其中Vβ13、Vβ14表现出寡克隆或寡克隆趋势。PML-RARα多肽联合SEA共同诱导，其T细胞表达TCR Vβ亚家族依然呈明显的限制性，且Vβ13、Vβ 14亚家族呈寡克隆、双克隆及寡克隆趋势。结论SEA能协同PML-RARα多肽诱导的T细胞克隆性活化与增殖。     

脐带血和成人外周血TCR Vγ和Vδ亚家族的分布和克隆性研究

目的探讨脐带血和健康成人外周血TCR Vγ和Vδ基因谱系的分布情况及克隆性特点。方法利用RT-PCR法检测16例脐带血和10例健康成人外周血单个核细胞TCRVγ(Ⅰ～Ⅲ)和Vδ(1～8)各亚家族的表达,了解各亚家族的分布和利用情况;阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析其CDR3长度,了解T细胞的克隆性。2例成人胸腺组织作为对照。结果脐带血T细胞的Vγ基因表达主要集中在VγⅠ和VγⅡ,而Vδ基因则平均表达(4.63±1.03)个亚家族,主要集中在Vδ1、2、3、8中表达。健康成人外周血T细胞除了1例不表达VγⅢ之外,其余均表达全部Vγ基因,而在Vδ基因中则平均表达(3.6±0.52)个亚家族,并以Vδ1、2和3为多见,Vδ4和Vδ5未能在外周血中检测到,而Vδ5和Vδ8的表达则明显低于脐带血(P=0.009,P=0.001);2例成人胸腺组织表达除Vδ4和Vδ6之外的其他Vγ和Vδ亚家族。基因扫描显示16例脐带血中有1例在VγⅠ和5例分别在Vδ2、Vδ4和Vδ6中出现寡克隆性,10例成人外周血中有9例在不同亚家族中出现克隆性T细胞,其余均呈多克隆性。结论脐带血TCRVγ和Vδ亚家族T细胞和健康成人外...     

AML患者外周血中TCR Vβ亚家族naive T细胞的检测

目的 检测急性髓性白血病(AML)患者外周血中TCR 23个Vβ亚家族的T细胞受体删除DNA环(sjTRECs)的存在特点,从而间接了解AML患者相应Vβ亚家族naive T细胞的近期胸腺输出情况.方法利用半巢式PCR分别扩增32例AML患者每5×104和1×104个外周血单个核细胞(PBMCs)中的23个Vβ亚家族sjTRECs,10例正常人外周血作为对照.结果在5×104和1×104两种PBMCs水平,AML患者检出sjTRECs的Vβ亚家族数分别为(5.09±3.28)和(2.59±2.06)个,与正常人的(13.70±2.67)和(5.50±2.07)个相比,两组的差异均有统计学意义(两组均为P=0.000).AML患者5×104个PBMCs中约可检测到5/23(20%)个Vβ亚家族sjTRECs,并且有13个Vβ亚家族sjTRECs的检出率明显低于正常人水平,其中Vβ10-和Vβ14-Dβ1 sjTRECs的检出率最低,而Vβ21最高.不同FAB分型AML患者间的检出差别未显示出统计学意义.32例AML患者检出sjTRECs的Vβ亚家族数量差别较大(1～15个),年龄与检出的亚家族数量呈负相关,＜30岁者的检出量高于≥30岁者,尤其在5×104个PBMCs水平差异有统计学意义(r=-0.481,P=0.005).结论 AML患者胸腺近期输出的23个Vβ亚家族naive T细胞存在不同程度的缺失或水平降低,表明AML患者存在严重的细胞免疫功能缺陷以及T细胞谱系重建的能力和潜能严重受损.     

独特型TCR Vβ2 DNA疫苗的构建和体外表达检测

目的:构建抗淋巴细胞白血病的独特型TCR Vβ2 DNA疫苗，并检测其转染K562细胞和体外表达情况。 方法:利用RT-PCR扩增表达TCR Vβ2的Molt-4细胞株的独特型TCR Vβ2基因片段，定向克隆于pIREs表达载体中，重组质粒转染至K562细胞中，利用间接免疫荧光法、SDS-PAGE和Western blotting等检测其表达情况。 结果:经PCR检测证实成功构建pIREs-TCR Vβ2重组子，转染至K562细胞后，利用Vβ2单抗可检测到K562细胞表面表达TCR Vβ2，SDS-PAGE分离检测为15 kD的蛋白质，并经Vβ2特异抗体Western blotting鉴定为TCR Vβ2蛋白。 结论:成功构建pIREs- TCR Vβ2 DNA疫苗，并可以在K562细胞株中表达特异蛋白。     

血管内皮生长因子基因反义核酸的设计及其对K562细胞增殖的影响

目的:试图用计算机设计并筛选出血管内皮生长因子(VEGF)的高效反义核酸;用实验方法研究VEGF反义核酸对K562细胞增殖的影响。方法:用RNAstructure(version3.7)软件,选择总自由能(overall△G₃₇)相对低的反义核酸,共计7条,长度18-20核苷酸,全硫代修饰;细胞培养72h,采用台盼蓝拒染法观察存活细胞,用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白水平,分析反义核酸对K562细胞的作用。结果:筛选出6条反义药物对K562细胞生长有明显抑制作用,均优于阳性对照组(X2)。与随机对照组(X1)相比,最优序列X7组细胞生长抑制率达31.9%、培养液中VEGF蛋白表达抑制率达51.4%,overall△G₃₇与反义药物活性密切相关(r=0.887,P<0.01)。结论:计算机辅助设计有助于获得更好反义药物,VEGF反义药物可抑制K562细胞生长及VEGF蛋白表达,内源性VEGF蛋白具有促进K562细胞增殖的功能。