截断逆挽方含药血清对D-氨基半乳糖诱导的人正常肝细胞LO2细胞增殖影响

目的研究截断逆挽方含药血清通过调控E2F1介导的细胞增殖途径减轻D-氨基半乳糖(D-Galactosamine,D-GlaN)诱导的人正常肝细胞LO2的损伤。方法体外培养LO2细胞,以D-GlaN进行造模,将细胞分为正常组、模型组、2.5%截断逆挽方含药血清组(2.5%JDNWF)、5%截断逆挽方含药血清组(5%JDNWF)、10%截断逆挽方含药血清组(10%JDNWF)。采用Cell Counting Kit-8(CCK8)法检测细胞活力;Real-time PCR检测转录因子E2F1、细胞周期蛋白E(cyclin E)、细胞周期蛋白A(cyclin A)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)、细胞分裂周期因子25A(cell division cyclin 25A,CDC25A)mRNA的表达;流式细胞术检测细胞周期;Western Blot检测分化调控因子DP1蛋白表达。结果截断逆挽方含药血清能显著促进LO2细胞进入S期(P<0.01),上调E2F1、cyclin E、cyclin A、CDK2、CDC25A mRNA的表达(P<0.01),并且能增加DP1蛋白的表达(P<0.05,P<0.01)。结论截断逆挽方减轻肝细胞损伤的作用机制可能与其促进肝细胞增殖有关。     

丙型肝炎病毒感染后持续的表观遗传改变将增加肝细胞癌发生风险

<正>全球约7 100万人感染丙型肝炎病毒(HCV),在约70%患者中,病毒持续存在,大多无症状。但持续的病毒感染会显著改变肝细胞的生理状态,包括脂肪变、肿瘤抑制因子表达改变、癌基因级联信号的激活和持续的慢性炎症。与此同时,代谢综合征、酗酒等协同因素可能成为慢性丙型肝炎患者严重肝损伤的主要原因,这些患者可进展为肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。近年来,高效的直接口服抗病毒药物(DAA)应用,使超过95%丙型肝炎患者获得HCV清除,也使丙型     

基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的建立

目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后,使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)分别进行酶切;根据松弛环状DNA(rcDNA)和cccDNA的结构差异,设计特异性扩增HBV cccDNA的引物,对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增;并筛选crRNA,建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果利用α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和HBV表面抗原(HBsAg)引物对双重酶切后的产物进行扩增,验证产物中HBV基因组的存在;利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增,验证了产物中只存在HBV cccDNA;利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释,然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测,计算出检测下限为10拷贝/μl。结论本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法,可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测,为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。     

HIV-1假病毒包装方法的探讨

目的：通过不同方案包装HIV-1假病毒,确定获得高重复性、高稳定性和高滴度假病毒的方法。方法从转染效率影响因素出发,通过不同的转染方案,利用pNL4-3 LucR-E-质粒与VSV-G质粒共转染293细胞包装病毒,分别于48 h和72 h收取假病毒并重新感染293细胞,48 h后测荧光素酶报告基因。结果成功包装出HIV-1假病毒,不同包装方案的病毒滴度不同,测得报告基因最高接近107 RLUs。结论应用PEI转染试剂、大提质粒pNL4-3︰VSV-G为4︰1时,转染效率最高,包装的假病毒滴度最高。     

干扰NBS1表达抑制肝癌HepG2细胞增殖并促进凋亡

目的:探讨干扰NBS1基因表达对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响。方法:应用Lipofectamine 2000将NBS1特异性小干扰RNA（siNBS1）转染至肝癌细胞HepG2中,以空载脂质体作为对照组。采用RT-PCR及Western blot法检测NBS1基因表达情况,采用CCK-8法检测转染质粒后siNBS1对HepG2细胞增殖能力的影响,采用流式细胞术检测siNBS1对HepG2细胞凋亡的影响。结果:不同浓度siNBS1（10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L）均能抑制HepG2细胞中的NBS1基因在mRNA水平上的表达（P＜0.05或P＜0.01）。最高浓度siNBS1（50 nmol/L）能抑制NSB1蛋白产物的表达水平（P＜0.05）。CCK-8实验显示,转染不同浓度siNBS1的HepG2细胞与对照组相比,细胞活力明显减弱（P＜0.05或P＜0.01）,转染48 h后增殖率下降最为显著;流式细胞检测结果显示,细胞凋亡的比率在转染后明显升高（P＜0.05或P＜0.01）,并随浓度增加而更为显著。结论:干扰NBS1基因的表达可以明显抑制HepG2细胞的增殖,并促进癌细胞凋亡。     

乙型肝炎病毒基因的整合机制及对宿主的影响

乙型肝炎病毒是导致慢性肝炎、肝纤维化、肝细胞癌的主要病因,目前认为乙型肝炎病毒基因整合在其致病机制中具有重要作用,本文试就该领域内目前研究成果做一综述．     

人角质化细胞生长因子2基因克隆、表达及其产物的纯化和鉴定

背景:人角质化细胞生长因子2具有广泛的生理功能,在胚胎发育、组织的修复、神经的再生、血管的生成和肿瘤发展中具有重要作用。目的:克隆人角质化细胞生长因子2基因,于大肠杆菌中表达,并检测其生物学活性,为进一步开发提供实验依据。设计:开放性实验。单位:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。材料:实验于2000-09/2002-05在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室完成。pBV220温控表达载体为病毒基因工程国家重点实验室构建,EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA连接酶(Promega公司);人角质化细胞生长因子2特异性聚合酶链反应引物(上海博亚生物技术有限公司合成);肝素-SepharoseCL-6B(Pharmacia公司);快速聚合酶链反应产物纯化试剂盒、总RNA提取Trizol试剂盒、反转录-聚合酶链反应试剂盒(GIBCO公司);质粒DNA快速提取试剂盒(博大公司);BL-21-codonpluscompentcells(Stratagene公司)。方法:用高表达菌株BL-21-codonpluscompententcells表达重组人角质化细胞生长因子2蛋白并初步纯化和检测其活性。通过反转录-聚合酶链反应从自然流产胎儿肺组织中钓取人角质化细胞生长因子2cDNA,将其克隆入pBV220载体质粒。在大肠杆菌BL-21-codonpluscompentcells中表达人角质化细胞生长因子2蛋白。采用亲和层析和离子交换层析分离纯化,以细胞增殖实验测定表达蛋白的生物活性。主要观察指标:人角质化细胞生长因子2cDNA的片段长度和序列,人角质化细胞生长因子2基因在大肠杆菌中的表达,纯化人角质化细胞生长因子2的活性。结果:人角质化细胞生长因子2cDNA片段大小约500bp,人角质化细胞生长因子2蛋白在BL-21中得到高效表达,于上清中可溶性表达,SDS-PAGE显示相对分子质量约20000;人角质化细胞生长因子2蛋白对NIH3T3细胞具有显著的促有丝分裂活性,1,5,10μg/L人角质化细胞生长因子2A值(490nm)高于空白对照组,差异有非常显著性意义(分别为0.174±0.022,0.220±0.029,0.306±0.050,0.066±0.004,P<0.001)。结论:成功克隆人角质化细胞生长因子2基因,并于大肠杆菌BL-21中得到高效表达;纯化的人角质化细胞生长因子2蛋白能刺激NIH3T3细胞的增殖,具有显著的促有丝分裂活性。     

髓源抑制细胞对HBV转基因小鼠肝脏炎症损伤抑制作用的研究

目的：建立HBV抗原特异性细胞毒性T细胞（CTLs）介导的小鼠肝炎模型,探讨肿瘤诱导的髓源抑制性细胞（MDSCs）在免疫介导的HBV转基因小鼠肝损伤中的有效性。方法制备新鲜的HBV转基因小鼠肝脏匀浆,予普通小鼠腹腔注射,1次/周,连续4周,以诱导致敏小鼠（Sensitized-mice）产生HBV抗原特异性CTLs（HBV-specific CTLs,HBV-CTLs）。分离致敏小鼠脾脏来源HBV-CTLs,静脉回输给高复制型HBV转基因小鼠,分别在注射前,注射后1 d、3 d、6 d和9 d经眶后取血测血清ALT/AST水平。分离荷瘤小鼠骨髓来源的MDSCs,静脉注射给HBV-CTLs诱导的肝炎小鼠,并在注射后24 h,经眶后取血测血清ALT/AST水平,肝脏组织经固定、石蜡包埋、HE染色进行组织形态学检测。结果致敏小鼠脾脏来源的HBV-CTLs可诱导HBV转基因小鼠肝组织损伤,血清ALT、AST水平呈升高趋势;且与CTLs注射组小鼠相比,CTLs联合MDSCs注射组小鼠肝脏组织损伤程度减轻,小鼠血清转氨酶水平显著降低[ALT：（254.5±25.50）vs （80.67±11.57）,P ＜0.05;AST：（301.5±40.50）vs（249.0±79.00）,P ＞0.05）]。结论静脉回输肿瘤诱导的MDSCs可有效减轻HBV-CTLs诱导的肝炎小鼠中肝组织损伤。     

肝细胞生长因子促进脊髓组织块离断神经突起再生的体外观察

背景：肝细胞生长因子可促进体外培养的皮层神经细胞突起生长，在无血清条件下支持皮层神经元的存活，因此被认为是一种新发现的神经营养因子。 目的：采用半固体培养基系统培养脊髓组织块，原位观察脊髓组织块神经突起再生及肝细胞生长因子对组织块神经突起再生的作用。 设计：观察对比实验。 单位：解放军军事医学科学院放射医学研究所实验血液学研究室。 材料：实验于2004-08／2005-05在解放军军事医学科学院放射医学研究所实验血液学研究室和基础医学研究所神经生物学研究室完成。选用40只Wistar胚胎大鼠，孕期14-16d，由解放军军事医学科学院动物中心提供。鼠尾胶原取自成年250&;#177;50g雄性Wistar大鼠。 方法：①用自备的鼠尾胶原制作半固体培养基系统，无菌条件下快速分离出孕期14-16d胚鼠的脊髓，剪成0．5-1．0mm^3的小块，置于半固体培养基中作为原代培养，组织块生长5d时，将发出的神经突起在距离脊髓组织块约200mm处离断，并在离断远端将约2mm^2大小的鼠尾胶去除，用2mL鼠尾胶原重新铺缺损区，待新铺鼠尾胶原固化后加液体培养基作为二代培养，在离断后0，l，6，12和24h，通过显微镜原位连续观察神经突起再生。②将突起离断后的培养基改为含0．5％的N3条件培养基，以加入10μg/L肝细胞生长因子作为实验组，加入含0.5％N3的无血清的DMEM培养基作为对照组，用每个组织块再生突起最长的3根突起长度均值代表这个组织块神经再生情况，每组分别观察12个组织块，24h后观察计算两组神经再生突起长度，比较两组神经突起再生情况。 主要观察指标：①原位神经突起再生情况。②对照组与实验组神经突起再生状况比较。 结果：①原位神经突起再生情况：刚离断时在离断部位两侧神经突起开始崩解，持续时间约1.2h，在离断近端延伸的距离约20mm。此后近端神经突起逐渐变得增粗、肿胀，神经突起停止崩解并开始向外延伸，神经再生开始，而且再生速度在划伤12h后明显加快。再生的神经纤维较划伤前的纤维分支增多。②对照组与实验组神经突起再生情况：实验组神经再生突起长度明显大于对照组[（375&;#177;96）mm，（200&;#177;75）mm,（P〈0.05）]。 结论：①建立了一种原位观察神经组织块突起再生的方法，此方法简单、经济。②肝细胞生长因子体外能促进脊髓组织块神经突起再生。     

丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒的诊断性能评价

目的 通过与Ortho3．0丙型肝炎病毒（HCV）抗体诊断试剂盒比较，分析评价EIAgenHCV抗体诊断试剂盒（EIAgen）的诊断性能。方法应用考核试剂EIAgen和参比试剂Ortho3．0HCV抗体诊断试剂盒对2881份样本进行检测，检测结果不一致时，应用重组免疫印迹试验（RIBA）确证试剂RIBAHCV3．0或核酸试验（NAT）确证试剂进行确证，以对结果进行综合分析。结果2881份样本中，考核试剂及参比试剂检测结果均为阳性，且参比试剂的测量值／临界值（S／CO）≥3．8，或检测结果符合确证试验阳性结果的阳性标本为274份，考核试剂及参比试剂检测结果均为阳性且参比试剂的S／CO〈3．8为59份，阴性标本2539份，不确定的9份被剔除。考核试剂检测真阳性274份，无假阴性结果；真阴性2527份，假阳性12份。考核试剂敏感度为100％，高于参比试剂的98，91％；特异度为99．53％，略低于参比试剂的99．88％。考核试剂对部分国内常见HCV基因型（1a型、1b型、2a型、3型和6型）样本27份，均为真阳性，敏感度为100％，对于非HCV感染的病毒性肝炎、自身免疫性疾病及妊娠样本具有良好的特异度，特异度均为100％。溶血、脂血样本对考核试剂检测结果无影响。考核试剂阳性预测值为95．80％，阴性预测值为100％，准确性为99．57％。考核试剂S／CO≥5．9的样本301份，其中用参比试剂检测S／CO≥3，8占88．70％；考核试剂S／CO〈5．9的29份，其中用参比试剂检测S／CO〈3．8占86．21％。结论EIAgen敏感度100％，特异度较好，是一种优秀的检测抗-HCVEIAgen试剂，尤其适用于阳性样本的筛选。采用EIAgen试剂检测样本，当S／CO≥5．9时，样本的阳性预测值较高。