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应用同源重组技术构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型打靶载体的策略 总被引:1,自引:0,他引:1
目的构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型基因敲入打靶载体,模仿低血钾周期性麻痹患者中的对应发现。方法采用置换型载体,分为长短、短臂设计(1.5~2.0kb),以便用聚合酶链反应(PCR)方法筛选中靶载体和ES细胞(embrgonic stem cell)。首先以Cchl1a3基因为模板设计引物,并引入与质粒内插入位点酶切序列相配的内切酶序列,扩增用于套取的同源臂a和b,以及用于插入筛选基因和实行定点突变的同源臂c和d,c和d首尾相接,用点突变特异性PCR在c内实现R528H突变。将a和b定向插入pBR322,借助于温度敏感的pSC101-BAD-gba-(tet)质粒的表达Red/ET重组酶,使其与携带Cchl1a3基因的细菌人工染色体(BAC)实现同源重组,套取含目的突变点、长约8kb的Cchl1a3的基因片断,形成pBR322-Cchl1a3。将c和d定向插入PL451质粒Frt-Neo-Frt片段两侧,酶切c-Frt-Neo-Frt-d片断纯化后,再与pBR322-Cchl1a3质粒一同转入含Red/ET重组酶基因的大肠杆菌EL250菌株,在重组酶的催化下再次实现同源重组,在Cchl1a3基因的给定位点实现R528H突变并插入包含筛选基因和重组酶识别位点的Frt-Neo-Frt片断,完成载体的构建。载体构建过程中,酶切位点变化导致的片断程度改变作为初筛,PCR产物测序结果作为最后的鉴定依据。结果打靶载体符合设计要求。结论运用点突变特异性PCR,结合Red/ET重组技术构建基因定点突变的基因敲入型打靶载体,在重组酶催化下仅需要2次同源重组即可完成。该策略成熟简便,省时省力,构建的载体易于鉴定。 相似文献
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非胰岛细胞肿瘤性低血糖 总被引:1,自引:0,他引:1
非胰岛细胞瘤性低血糖(NICTH)泛指由胰岛细胞瘤之外的其他肿瘤导致的低血糖症,肿瘤分泌的非胰岛素物质代替胰岛素发挥胰岛素的降血糖作用,导致低血糖发生,而机体本身的胰岛素分泌却受到抑制。最主要的非胰岛素物质是肿瘤分泌大分子的胰岛素样生长因子-2(bIGF-2),它与正常的胰岛素样生长因子IGF-2不同,不能与IGF结合蛋白形成大分子的复合物,而是以小分子或游离方式存在于组织间液中,易于IGF受体结合,刺激肝外组织过度利用葡萄糖,致使低血糖发生。其具有发病年龄大、症状重、巨大肿瘤、胰岛素分泌受抑制、bIGF-2高分泌等特点。治疗以手术为主,如不具备手术指征,应以缓解低血糖发作为目标。 相似文献
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目的 检测中国人群中低钾型周期性麻痹(HPP)家系CACNA1S和SCN4A基因的突变情况,并与既往文献报道的西方白种人群HPP基因突变情况进行比较分析.方法 应用PCR和DNA测序技术,对2个家族性HPP家系、1个甲亢性HPP家系和4例散发性HPP患者的CACNA1S基因和SCN4A基因进行测序,与基因库中的参考序列比对,以确定是否存在突变.在PubMed数据库中,搜集1999年1月-2012年12月公开发表的关于HPP家系CACNA1S、SCN4A基因突变的相关文献,最终纳入9篇文献.结果 先证者均存在伴有血清钾降低的发作性肌无力、肌无力常累及四肢等典型的HPP临床表现,辅助检查证实血清钾降低,心电图提示低钾性改变,肌电图提示运动电位时限短、波幅低,诊断明确.3个家系的先证者和家族成员以及4例散发性HPP患者的CACNA 1S和SCN4A基因中未发现突变位点.既往文献显示,西方白种人群中HPP患者CACNA1S及SCN4A基因的突变阳性率远高于中国人群.结论 中国人群HPP患者CACNAIS和SCN4A基因突变率极低,与西方白人患者的检测结果存在差异. 相似文献
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目的探讨2型糖尿病D型性格患者的疾病及社会心理特点.以及对血糖的控制的影响。方法采用自行设计的问卷,内容包括糖尿病患者年龄、性别、病程、胰岛素使用时间、糖化血红蛋白(HbAlc)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、体质指数(BMI)、收缩压及舒张压等指标,以及家庭人均月收入、文化程度、职业等其他指标;焦虑与抑郁分别采用自评量表、D型性格采用Denollet编制的DS14自评量表,对我院门诊糖尿病患者161例进行自我测评。DS14中的负性情感(NA)和社交抑制(SI)评分同时≥10分为D型性格,焦虑和抑郁则各自的评分≥50分。结果D型性格占34.1%。除血肌酐、焦虑评分D型性格与非D型性格差异具有统计学意义外(P〈0.05),其他指标均无统计学意义。D型性格者焦虑的发生率较低。结论糖尿病患者D型性格的比例明显增多,但对血糖控制无明显影响;血肌酐升高患者D型性格得分高;D型性格的糖尿病患者不易发生焦虑。 相似文献
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