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1.
目的比较采用普通RT-PCR和不对称PCR分别进行样品的直接荧光标记,应用于cDNA芯片杂交,分析其对芯片杂交效率的影响。方法以本实验室建立保存的重组质粒和病毒为模板,进行不对称RT-PCR引物浓度优化,应用普通RT-PCR与不对称RT-PCR进行直接荧光标记,将标记的产物与制备的cDNA芯片杂交,在相同条件下完成杂交后芯片的洗涤与扫描,记录扫描图片与数据。结果与普通RT-PCR标记方法相比,应用不对称RT-PCR技术标记单链靶基因,能特异有效提高芯片的杂交效率。结论应用不对称RT-PCR技术对样品进行荧光标记后,与cDNA芯片杂交能提高芯片的杂交效率,有利于cDNA芯片的检测应用。  相似文献   
2.
目的 构建人食管癌细胞cDNA噬菌体表达文库。方法 从食管癌细胞中提取总RNA,利用磁珠吸附法分离其中的mRNA,逆转录合成cDNA第一链,再通过碱基互补配对原则合成第二链,对双链cDNA进行末端修饰,连接EcoRⅠ适配子,磷酸化EcoRⅠ适配子5′端,除去不合要求的cDNA片段,将符合要求的与载体(噬菌体T7 Select10-3b)连接,然后进行体外包装建成初步的cDNA文库,并对文库进行鉴定。结果 食管癌细胞cDNA原始表达文库的滴度为2.01×106 pfu/mL,重组率高达100%,插入片段的大小范围在300~1 500 bp之间。结论 本实验成功构建了人食管癌T7噬菌体展示cDNA表达文库,并经过了初步鉴定,为下一步利用重组表达cDNA克隆的血清学分析技术(SEREX技术)鉴定食管癌相关抗原奠定基础。  相似文献   
3.
目的:对H1N1 流感病毒血凝素HA 的抗原表位初步筛选。方法:用噬菌体展示文库对2 株抗体的结合位点进行筛选,将筛选的抗原位点结合HA 序列进行多肽合成,免疫小鼠制备单克隆抗体,通过分子生物学手段对4 株抗体的轻链和重链可变区基因进行调取,通过计算机模拟抗体序列结合的抗原的结构域,推测抗体结合的氨基酸位点。结果:噬菌体文库筛选得出抗体的结合序列富含组氨酸和精氨酸,将针对多肽的单克隆抗体的序列和前期获得的2 株抗HA 单克隆抗体的序列比对分析,发现A1-8 和anti-14p 结合的HA 抗原序列相一致,H1-13 和anti-11p 结合的HA 抗原序列相一致。结论:通过将噬菌体展示文库技术和计算机模拟预测抗原抗体结合,可以有效筛选抗原表位,为流感病毒HA 抗原表位预测方法的完善提供理论基础。  相似文献   
4.
利用基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交技术,构建人永生尿道上皮细胞(SV-HUC-1)cDNA文库。Trizol法提取人尿道上皮细胞总RNA,并分离纯化其mRNA;以mRNA为模板,合成cDNA第一链、第二链;通过T4 DNA聚合酶将DNA链两端加上5′接头;并将其大于1 kbp的片段与膜蛋白酵母双杂交载体pPR3-N连接,经电转化大肠杆菌感受态细胞,以构建基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并检测文库的库容量和随机性。本研究成功构建了人尿道上皮细胞的基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,为进一步研究泌尿生殖道感染病原体与宿主尿道上皮细胞的相互作用奠定了实验基础。  相似文献   
5.
目的 筛选与广州管圆线虫感染小鼠血清具有较强免疫反应性的优势诊断抗原.方法 用感染广州管圆线虫21 d的小鼠感染血清做免疫探针筛选广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA表达文库,对筛选得到的阳性克隆进行插入片段的测序和生物信息学分析,再根据测序结果设计引物扩增该基因并将其克隆入PET-30a(+)载体中.结果 共获得6个阳性克隆,经DNA测序及同源性分析表明,发现其中2个与广州管圆线虫髓鞘转录因子1(MYTl)高度同源,1个与广州管圆线虫胶原蛋白家族基因(alpha-collagen)高度同源,且均为全长cDNA.克隆出广州管圆线虫MYT1全长cDNA序列,构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符合的目的片段.结论 用感染小鼠血清作为探针初步筛选到2个广州管圆线虫基因,并成功构建MYT1的原核表达重组质粒PET30a(+)-MYT1.  相似文献   
6.
7.
目的探讨通过石蜡包埋组织标本构建肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)肿瘤组织基因组DNA文库的方法。方法收集符合要求的石蜡包埋HCC肿瘤组织标本,运用组织裂解改良法提取基因组DNA,构建HCC肿瘤组织基因组DNA文库,通过SmartSpecTM核酸蛋白测量法、TaqMan-MGB-PCR及琼脂糖凝胶电泳法等分析评估所得文库质量。结果本研究共收集到2 108例合格石蜡包埋HCC肿瘤组织标本,构建了HCC组织标本基因组DNA文库,经质量监控分析所得DNA的浓度大于或接近0.1μg/μl,对应A260/A280比值介于1.6~2.0,TaqMan-MGB-PCR实时定量曲线光滑、波峰单一,琼脂糖凝胶电泳条带单一、清晰、无拖尾现象,所构建的文库DNA质量较好,与对照DNA质量相比差异无显著性(P>0.05)。结论通过石蜡包埋组织标本可构建用于HCC研究的肿瘤组织基因组DNA文库。  相似文献   
8.
RNA干扰是双链RNA分子诱发的基因沉默过程,可体现在转录水平或转录后水平.设计针对多个靶基因的RNAi序列,构建RNAi文库进行系统性筛选是生物学及医学研究的有力工具.在当前对肿瘤的研究中,RNAi文库有着无法比拟的优势,已被广泛用于肿瘤发生相关基因筛选、药物靶点筛选及克服肿瘤细胞耐药性等多个领域.本文就RNAi技术及RNAi文库在肿瘤研究中的应用做一综述.  相似文献   
9.
王阿娜  裴瑾  刘薇  万德光  张祎楠 《中成药》2012,34(7):1377-1380
目的 研究桑叶片总RNA的提取方法.方法 采用Trizol法、CTAB法及RNA prep prue Plant Kit提取试剂盒提取法,分别提取桑叶片中的总RNA,并通过紫外光谱、琼脂糖凝胶电泳及RT-PCR对提取效果进行分析比较.结果 3种方法均能从桑叶片中提取分离到总RNA,其中Trizol法能提取纯度较高、完整性较好的RNA,18S及28S带型清晰无弥散,A260/A280值为1.99,RNA产率为594.24μg/g,提取的总RNA适用于RT-PCR实验.结论 用Trizol法提取的桑叶片中总RNA可用于cDNA基因文库的构建及基因表达的差异分析.  相似文献   
10.
刺五加肌动蛋白基因的克隆和表达稳定性分析   总被引:2,自引:2,他引:0  
邢朝斌  龙月红  修乐山  柴丽花  周秘 《中草药》2013,44(13):1819-1822
目的 克隆刺五加Eleutherococcus senticosus的肌动蛋白(actin,ACT)基因并使其成为可用的内参基因.方法 运用RT-PCR法克隆ACT基因的部分序列,并以其为内参基因进行半定量PCR和real-time PCR分析.结果 克隆了长度为1 031bp的刺五加ACT基因,推测其编码343个氨基酸,与光皮桦Betula luminifera、陆地棉Gossypium hirsutum、茶树Camellia sinensis的ACT氨基酸序列同源性分别为99.42%、98.83%、98.54%.刺五加ACT基因在不同器官和不同生长发育时期的表达量基本恒定,以其为内参基因的半定量PCR和real-time PCR均具有良好的扩增效果和重现性.结论 首次分离并报道了刺五加ACT的cDNA克隆,证实该序列可以作为基因表达分析的内参基因,建立了其real-time PCR反应体系.  相似文献   
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