乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70在毕赤酵母中的融合表达

目的构建乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70（Mycobacterium tuberculosis heat shock protein70，Mt．hsp70）基因融合表达载体，并研究其在巴斯德毕赤酵母中的表达情况，为改善发展新的乙脑疫苗打基础。方法以酵母表达载体pPICZa-A为基本单位构建E蛋白基因主要抗原片段与hsp70的融合表达载体，融合基因以酶切位点BamHⅠ连接，用电穿孔法转化酵母X-33，用Zeocin平板筛选重组子，经甲醇诱导表达后，SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果E蛋白基因与hsp70的融合表达载体构建成功，SDS-PAGE显示，其相对分子质量为114kD，与实际大小相符，经凝胶薄层扫描分析，表达量为33mg／L，经Western印迹验证，有良好的抗原性。结论E—hsp70融合蛋白在酵母中的表达为下一步研究hsp70是否能作为E蛋白免疫时的理想佐剂作准备。     

构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3 mAb的人源化Fab

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。结果:分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。     

血凝素蛋白裂解位点对H5亚型禽流感病毒侵入细胞的影响

目的通过RT—PCR反应获得了H5N1亚型禽流感病毒完整的血凝素基因（HA）并克隆到真核表达载体pcDNA3上，通过转染293T细胞进行了瞬时表达验证。方法采用PCR定点突变技术，将其HA基因裂解位点的氨基酸组成由RKKR↓GLF突变为RSSR↓GLF，使其具有低致病性AIV的分子特征，并构建了表达突变后HA基因的真核表达载体pcDNA—Hm。将pcDNA—H5和pcDNA—Hm分别与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHTT60和pHIT111共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T后，收集转染细胞上清，通过Western—blot和细胞感染性实验来研究假病毒的特性。用缺乏囊膜蛋白和已经证实可以形成MuLV假病毒的水泡性口炎病毒糖蛋白G作为对照。结果转染后形成假病毒进行裂解后进行Westem—blot证明两种HA蛋白都能够整合到各自的假病毒颗粒表面，野生型的HA可以检测到三条带，分别与HA0、HA1和HA2大小相符，而突变后的HAm则仅能检测到一条带，与HA前体大小相符，说明其失去了裂解活性。通过感染293T、COS-7和NIH3T3三种不同的靶细胞后发现野生型的HA所形成的假病毒MuLV—H5具有感染性和泛嗜性，而突变后的HA所形成的假病毒则失去了感染性。结论可以得出HA蛋白裂解位点的氨基酸组成不仅对H5亚型禽流感病毒的致病性有影响，对禽流感病毒侵入细胞也具有至关重要的作用。     

流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析

目的　获得JEVE蛋白基因并使其在E coli中高效表达 ,以研究其抗原活性 ,为进一步研制ELISA早期诊断试剂盒奠定基础。方法　根据已发表的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株序列 ,设计一对特异性引物 ,通过RT -PCR扩增出E蛋白基因的cDNA片段 ,并将其克隆入 pET - 32a(+)表达载体中 ,构建重组融合表达载体pET -E ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后 ,利用IPTG诱导获得高效表达。结果　扩增的E蛋白基因片段长 1113bp ,编码 371个氨基酸残基 ,该基因片段与国内发表的减毒株SA14 - 14 - 2碱基序列同源性为 10 0 %。表达产物分子量约为 6 2kD ,经Westernblotting分析表明表达产物具有较好的抗原性。结论　通过序列分析表明 ,我国的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株未发生基因突变。表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性分析为今后ELISA早期诊断试剂盒的研制提供了依据。     

口蹄疫病毒VP1基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建表达O型口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease Vims,FMDV)VP1基因的重组腺病毒并对其进行鉴定.方法 将FMDV VP1基因克隆到腺病毒的穿梭载体pAdeno Vatotr-CMV5-IRES-GFP中.得到的阳性穿梭质粒经Pme Ⅰ酶线性化后.利用电转化技术将线性化的阳性质粒与腺病毒骨架载体pAdeno Vator△E1/E3共转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞,使其在大肠杆菌中进行同源重组.将筛选到的重组病毒质粒经Pac-Ⅰ酶线性化后暴露出包装信号,通过脂质体LipofectamineTM2000转染HEK-293A细胞后得到重组病毒.利用报告基因GFP和细胞病变检测重组病毒滴度和感染效率,通过PCR和westem-blot检测FMDV VP1基因在重组腺病毒中的表达.结果 成功构建了表达FMDV VP1基因的重组腺病毒rAd5-VP1,其滴度为1011.87个TCID50/mL.western-blot检测重组腺病毒rAd5-VP1能与FMDV阳性血清发生反应.结论 重组腺病毒rAd5-VP1能与FMDV阳性血清发生反应,PCR和westem-blot检测FMDV VP1基因在重组腺病毒中稳定表达.     

共表达口蹄疫病毒VP1-2A与猪IFN-α的重组腺病毒增强小鼠免疫功能

目的构建串联表达口蹄疫病毒VP1-2A和猪干扰素-α的重组腺病毒,并研究重组病毒对小鼠特异性免疫的影响。方法将FMDV VP1-2A基因和α干扰素基因先后克隆到腺病毒的穿梭载体中,得到的阳性穿梭质粒与腺病毒骨架载体在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。重组腺病毒质粒感染HEK293A细胞,获得重组腺病毒rAd5VP1-2A-poIFN-α。用rAd5VP1-2ApoIFN-α免疫BALB/c小鼠,同时设注射单独表达FMDV VP1的重组腺病毒(rAd5VP1)和空腺病毒的对照组。通过ELISA检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a及细胞因子IL-4、IFN-γ的表达水平;MTT法检测淋巴细胞增殖指数。结果成功构建了共表达FMDV VP-2A和IFN-α的重组腺病毒rAd5VP1-2A-poIFN-α。小鼠免疫实验结果显示,与单独表达FMDV VP1基因的重组腺病毒rAd5VP1相比,重组腺病毒rAd5VP1-2A-poIFN-α能增强特异性IgG、IgG1和IgG2a的分泌,促进IL-4和IFN-γ的分泌,并能增强小鼠淋巴细胞增殖功能。结论重组腺病毒rAd5VP1-2A-poIFN-α能明显增强小鼠特异性免疫应答。     

马立克病疱疹病毒基因组IRL区一特异性cDNA基因在大肠杆菌中的表达研究

目的　了解从人工感染马立克病疱疹病毒 ( MDV)致瘤毒株京 - 1株发病鸡内脏淋巴肿瘤组织中分离鉴定到的 ,定位于 MDV基因组 IRL区 Bam HI- I 2和 L片段内的一长 72 0 bp特异性 c DNA基因在大肠杆菌表达系统中的表达能力。方法　将该 c DNA基因克隆进色氨酸 ( Trp)启动子控制下的大肠杆菌表达质粒 PATH 2 3中 ,连接质粒转化受体菌 DH5α。分别采用原位杂交、斑点杂交和 PCR法对重组转化子进行筛选鉴定 ,最终获得 4个阳性克隆。任意选择一克隆在 β-吲哚丙烯酸( IAA)诱导下作融合表达 ,表达产物经包涵体提取 ,SDS- PAGE电泳初步鉴定。结果　该 c DNA基因在大肠杆菌系统中得到了部分表达 ,且表达蛋白分子质量为 3 9～ 4 1ku。结论　有关源自 MDV中国特有致瘤地方株京 - 1株的 72 0 bp c DNA基因分离鉴定及其在大肠杆菌中的表达研究 ,尚属首次 ;尤其是大肠杆菌中的成功表达更有助于对 MDV肿瘤候选基因—— meq基因的研究     

法氏囊活性肽-Ⅱ对肿瘤细胞增殖的抑制作用及其可能机制

目的： 研究法氏囊活性肽（Bursal-derived pentapeptide,BPP）-Ⅱ对肿瘤细胞增殖的抑制作用及其可能的作用机制。 方法： 采用不同质量浓度(0.02、0.2、2、20 μg/ml)的BPP-Ⅱ分别处理小鼠B细胞淋巴瘤细胞WEHI-231、人鼻咽癌细胞CNE、大鼠肝癌细胞RH-35和正常细胞系人胚肾细胞293、猪肾细胞PK15、中国仓鼠卵巢细胞CHO,48 h后采用MTT法检测细胞增殖情况;以双荧光素酶报告系统和Western blotting方法检测BPP-Ⅱ对荧光素酶标记的p53-Luc质粒转染的Vero细胞中 p53 转录活性和P53蛋白表达的影响;利用噬菌体随机12肽库筛选BPP-Ⅱ特异性结合肽,人工合成BPP-Ⅱ结合肽,采用MTT法检测BPP-Ⅱ结合肽对BPP-Ⅱ抗WEHI-231细胞增殖能力的影响。 结果： 2和20 μg/ml 的BPP-Ⅱ对肿瘤细胞WEHI-231 、CNE、RH-35的增殖均有抑制作用（均P<0.05）,而对正常细胞系293、PK15、CHO的增殖均不表现出抑制作用。BPP-Ⅱ明显激活 p53 基因的转录,并上调P53蛋白的表达。应用噬菌体展示技术筛选获得3个BPP-Ⅱ结合肽P3-12、P5-12、P6-12,其中2和20 μg/ml的P3-12能显著抑制BPP-Ⅱ的抗WEHI-231细胞增殖能力\[（97.5±3.4）%、（98.9±3.5）% vs （86.3±1.9）%, P<0.05 \];20 μg/ml 的P5-12和P6-12均能显著抑制BPP-Ⅱ的抗WEHI-231细胞增殖能力\[（96.7±3.1）%、（95.4±3.8）% vs （86.3±1.9）%,P<0.05\]。 结论： BPP-Ⅱ可特异性抑制WEHI-231、CNE、RH-35等肿瘤细胞增殖,其机制可能与激动 p53 信号通路有关。     

丙型肝炎病毒基因和蛋白结构研究进展

估计全球约有1．7亿人口感染丙型肝炎。是一种严重影响人类健康的传染病。丙型肝炎的病原为丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus。HCV)。1989年Choo等人首先获得HCV基因组的cDNA全序列。使HCV成为病毒学史上第一个首先通过基因克隆技术确认的病毒。此后。HCV的分子生物学研究进展迅速。现将HCV病毒分子结构的最新研究状况做一综述。