利用五特征转基因小鼠获得的全人源抗VEGF单抗的抑制血管生成及抗肿瘤活性

为研究一种全人源抗VEGF单克隆抗体在体外和体内的抑制血管生成和抗肿瘤活性,利用细胞划痕实验检测抗体抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）迁移的活性;MTT法检测抗体抑制分泌VEGF的肿瘤细胞增殖能力;Annexin V/PI 双染检测抗体诱导肿瘤细胞凋亡活性;通过建立胃癌原位模型,静脉注射给予不同剂量的抗体,免疫组化方法检测抗体在体内的抑制血管生成和抗肿瘤活性。结果表明一定剂量的全人源抗VEGF抗体能够显著抑制HUVEC细胞的迁移,明显抑制4种分泌VEGF的肿瘤细胞增殖并显示了一定的诱导肿瘤细胞凋亡的能力。静脉注射一定剂量的抗体能够显著抑制胃癌原位肿瘤的生长和肿瘤血管生成。进而表明该全人源抗VEGF单克隆抗体能够在体外和体内都表现出显著的抑制血管生成和抗肿瘤活性。     

利用五特征转基因小鼠制备全人源血管内皮生长因子165单克隆抗体

目的： 利用转入人免疫球蛋白基因的五特征小鼠制备全人源血管内皮生长因子165（VEGF_165）单克隆抗体,并初步探讨该单抗的抗肿瘤活性。方法： 采用常规杂交瘤细胞融合技术,利用间接ELISA效价测定方法筛选能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株;比较了五特征小鼠和BALB/c小鼠的免疫效果;亲和色谱法从腹水中纯化单抗;利用分泌VEGF的人膀胱癌细胞系T24细胞考察单抗的体外抗肿瘤活性。结果： 成功获得了4株能稳定分泌表达单抗的杂交瘤细胞株（V₂,V₅₀,V₇₁,V₇₅）,建立了间接ELISA效价测定方法,发现同样方法免疫的BALB/c鼠血清效价约为五特征小鼠的10倍。采用甘露糖结合蛋白（MBP）亲和色谱柱从腹水中获得了纯化的单抗样品,经SDS-PAGE和Western blotting检测,证实该单抗为全人源VEGF₁₆₅IgM单抗。体外抗肿瘤活性结果显示,V₂、V₇₅单抗对人类膀胱癌细胞系T24细胞的增殖有较好的抑制作用。结论： 可利用五特征小鼠制备全人源抗VEGF₁₆₅单抗,该单抗具有潜在的抗肿瘤活性。     

旋毛虫ES抗原基因的克隆和序列分析

目的　完成旋毛虫ES抗原 (Excretory -secretoryAntigen)中 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原基因的克隆和测序 ,并与已发表的该两种基因的相关序列比较、分析。方法　通过RT -PCR ,从旋毛虫幼虫总RNA中扩增得到特异性片段 ,利用TA克隆将PCR产物克隆入 pUC -T载体中并进行测序及同源性比较。 结果　RT -PCR扩增得到 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原基因 ,序列分析表明 ,其核苷酸序列与已发表的 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原的同源性均为 99%。结论　成功提取了旋毛虫幼虫的总RNA ,并用PT -PCR方法克隆了 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原基因 ,这为两基因的表达及在医学、兽医学中应用研究奠定了基础。     

猪瘟病毒E2蛋白重复多表位基因的融合表达及其兔体免疫保护研究

目的：研究猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重复多抗原表位基因的融合表达及其免疫攻毒保护作用。方法：应用PCR方法扩增猪瘟病毒E2蛋白重复多抗原表位基因，构建重复多表位基因的原核重组表达质粒PGEX-3E，进行融合蛋白的表达和纯化。ELISA和Western blot方法测定单表位融合蛋白GST-E和多表位融合蛋白GST-3E与猪抗CSFV的阳性血清和兔抗E2阳性血清的反应性，并进行融合蛋白的兔体免疫及免疫攻毒保护的比较研究。结果：分子克隆和构建了原核重组表达质粒pGEX-3E，表达和纯化了融合蛋白GST-3E；单表位融合蛋白与重复多表位融合蛋白均能够与猪抗CSFV的阳性血清反应和兔抗E2的阳性血清产生免疫反应。在刺激兔体产生抗体方面，单表位融合蛋白刺激兔体产生抗体的能力较弱，而多表位融合蛋白则能够使兔体产生高效价的抗体。接种100MID50剂量猪瘟兔化弱毒(HCLV)进行的兔体免疫攻毒保护试验表明，空白对照组和载体蛋白GST免疫组无保护作用，单表位融合蛋白免疫组具有一定的免疫保护作用，而重复多表位融合蛋白免疫组则完全能够抵抗猪瘟病毒的攻击。结论：猪瘟病毒E2蛋白重复多表位的融合表达具有免疫保护作用，本实验的成功完成为猪瘟病毒多表位抗原的串联及多表位疫苗的研究奠定了基础。     

乳腺特异高表达人促红细胞生成素转基因奶山羊的制备

目的制备乳腺特异性高表达人促红细胞生成素（hEPO）转基因奶山羊。方法采用牛β-乳球蛋白基因（BLG）调控元件和hEPO全长编码序列基因组DNA构建真核表达载体，应用受精卵原核注射的方法制备hEPO转基因山羊。结果在原核注射获得的188头羔羊中，经Southern blot法检测有4头羊含有hEPO基因，其中3头为母羊，1头公羊于出生后20d死亡；3头转基因母羊hEPO基因的拷贝数分别为1、10、2；Western blot检测结果显示转基因羊乳中的hEPO分子质量为32kDa；MTT法检测结果表明，在泌乳10d的3只转基因羊乳汁中，每毫升乳汁中hEPO活性分别达到1.17×10^2IU、1.90×10^4IU、1.91×10^4IU。结论牛BLG能够调控hEPO基因在山羊乳腺中高表达，为实现其他药用蛋白在山羊乳腺中表达奠定了基础。     

鸡干扰素基因的分子克隆与序列测定

目的：从接种新城疫Ｆ４８Ｅ９病毒的Ｌａ Ｓｏｔａ疫苗免疫鸡体外有丝分裂原刺激的脾淋巴细胞中克隆鸡干扰素基因。方法：应用逆转录多聚酶链式反应技术扩增,常规平端连接、转化及序列测定技术进行验证。结果：研究表明克隆得到的基因与国外报道的鸡胚成纤维细胞干扰素基因。结论：鸡在该状态下其脾淋巴细胞表达鸡胚成纤维细胞干扰素ｍＲＮＡ。     

猪瘟病毒E2糖蛋白抗原表位的预测、多肽合成及特性研究

目的：研究CSFV E2蛋白免疫原性肽的生物学特性。方法：应用计算机分析软件对猪瘟病毒＆糖蛋白的抗原表位进行了预测，结合＆基因的变异分析，人工合成了两条多肽(Pep1和Pep2)序列，与抗mE2蛋白的兔血清和抗mE2的8株单抗进行反应，并将两条多肽分别与载体蛋白(BSA)进行偶联和免疫家兔。结果：两条多肽均与兔的抗血清及单抗A11反应；多肽Pep2与单抗D5和D8反应。多肽Pep1与BSA载体蛋白偶联(Pep1-BSA)，免疫家兔后能够产生针对多肽Pep1的抗体。结论：两条多肽Bep1和Pep2中，只有多肽Pep1具有很好的反应原性和免疫原性。     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原基因的分子克隆与基因分型

从我国华中、华东、华南、华北、东北及西北等地分离鸡传染性支气管炎病毒流行株，经病毒的病原性、形态结构、理化特性、病毒抗原的特异性检测、组织嗜性、结构多肽及血清型分析等多方面的鉴定，对来源于我国不同地区的流行毒株免疫原Ｓ１基因进行了分子克隆及基因分型；ＲＴ－ＰＣＲ扩增病毒Ｓ１基因，将Ｓ１基因５′和３′端分别进行分子修饰之后插入克隆载体ｐＵＣ１８的ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ位点，在Ｅｃｏｌｉ中实现了目的基因的克隆；利用英国病毒株Ｓ１全基因核酸探针与流行株Ｓ１基因的重组克隆质粒分子杂交及目的基因５′端高变区核苷酸序列分析鉴定后，采用ＨａｅⅢ、ＰＶＵⅡ和ＸｂａⅠ等限制性核酸内切酶酶切分析不同流行株Ｓ１基因ｃＤＮＡ。结果表明，我国流行的鸡传染性支气管炎病毒分为６个主要的基因型；试验发现除与Ｍ４１和澳大利亚Ｔ株相近基因型毒株之外，我国流行的毒株存在明显的分子水平的变异，这与病毒血清型鉴定的结果一致，鸡传染性支气管炎病毒中国流行毒株免疫原基因Ｓ１的分子克隆及基因分型为该病毒分子流行病学及病毒遗传变异的主要分子基础的深入研究奠定了基础。     

牛分枝杆菌mpb64基因在Vero细胞中的瞬时表达

牛结核病作为一种严重的人畜共患病已越来越受到人们的重视，尽管大多数国家不提倡用疫苗来预防牛结核病，但由于牛结核病病原体牛分枝杆菌与结核杆菌基因组同源性高达99％以上，因此研制针对牛结核病的DNA疫苗对于牛结核病的预防和开发人结核病新型疫苗无疑具有重要的意义。