治伤巴布剂对大鼠急性软组织损伤模型P38MAPK、AKT信号通路的影响＊

目的 观察治伤巴布剂对急性软组织损伤（acute soft tissue injury， ASTI）模型p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、丝/苏氨酸蛋白激酶（AKT）信号通路的影响，探讨治伤巴布剂干预ASTI的可能作用机制。方法 将40只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为正常对照组、模型对照组、治伤巴布剂组、p38MAPK信号通路抑制剂组、AKT信号通路抑制剂组，每组8只。除正常对照组外，其余四组均予以左侧后肢小腿ASTI造模。造模成功后，治伤巴布剂组于标记部位立即予治伤巴布剂（修剪成1.5x3cm大小）外敷，并用胶布固定；其余四组均予等剂量赋形剂（修剪成1.5×3 cm大小）外敷处理，胶布固定；持续外敷，共持续24 h。p38MAPK信号通路抑制剂组在造模前30 min予腹腔注射p38MAPK信号通路抑制剂SB203580（400 μg/kg/天）1次；AKT信号通路抑制剂组在造模前30 min予腹腔注射AKT信号通路抑制剂perifosine（20 mg/kg/天）1次。分别于0（造模前）、2h、4h、8h、12h、24h测量受伤小腿肌肉处的周长，并计算肌肉肿胀率（muscle swelling rate，MSR）。24 h药物干预结束后，采用颈椎脱臼法处死大鼠。后将左侧后肢小腿损伤中心部位进行取材，分成三份。一部分用于观察组织病理学形态变化；一部分用于逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）p65 mRNA、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA、白细胞介素-1β（IL-1β）mRNA表达水平；剩下部分用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测骨骼肌组织TNF-α、IL-1β含量水平及蛋白质免疫印迹（Western-blot）法测定p38MAPK、AKT、NF-κB p65、核因子抑制蛋白α（inhibitor kappa B alpha， IκBα）表达水平。结果 与正常对照组相比，模型对照组MSR显著增加（P<0.01）；病理形态学上，骨骼肌组织可见大面积肌细胞排列紊乱，肌细胞变性坏死，间质内可见红细胞聚集及大量炎症细胞浸润；骨骼肌组织TNF-α、IL-1β含量水平显著升高（P<0.01）；磷酸化p38MAPK（p-p38）/总p38MAPK（t-p38），磷酸化-AKT（p-AKT）/总-AKT（t-AKT）明显升高（P<0.01），NF-κB p65及NF-κB p65mRNA表达水平明显升高（P<0.01）。与模型对照组相比，治伤巴布剂组MSR在治疗第8 h、12 h、24 h显著下降（P<0.01），且在治疗第24 h，其MSR较p38MAPK、AKT信号通路抑制剂组下降更明显（P<0.05）；病理学评分显著下降（P<0.01），且较p38MAPK、AKT信号通路抑制剂组下降更显著（P<0.05）；骨骼肌组织TNF-α、IL-1β含量水平明显下降（P<0.01），且较p38MAPK、AKT信号通路抑制剂组更显著（P<0.05）；p-p38/t-p38及p-AKT/t-AKT明显下降（P<0.01），NF-κB p65及NF-κB p65 mRNA表达水平显著下降（P<0.01），且较p38MAPK、AKT信号通路抑制剂组在降低NF-κB p65及NF-κB p65 mRNA相对表达值方面更显著（P<0.01）。结论 治伤巴布剂可能同时对p38MAPK、AKT信号通路产生了一定的抑制作用，引起NF-κB活性下调，NF-κB p65蛋白的表达下调，进而引起骨骼肌组织TNF-α、IL-1β炎性细胞因子含量水平下调，减轻ASTI炎症反应，从而改善ASTI。     

Knockdown of DEAD-box 51 inhibits tumor growth of esophageal squamous cell carcinoma via the PI3K/AKT pathway

BACKGROUND Esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)is one of the most prevalent malignancies that seriously threaten people’s health worldwide.DEAD-box helicase 51(DDX51)is a member of the DEAD-box(DDX)RNA helicase family,and drives or inhibits tumor progression in multiple cancer types.AIM To determine whether DDX51 affects the biological behavior of ESCC.METHODS The expression of DDX51 in ESCC tumor tissues and adjacent normal tissues was detected by Immunohistochemistry(IHC)analyses and quantitative PCR(qPCR).We knocked down DDX51 in ESCC cell lines by using a small interfering RNA(siRNA)transfection.The proliferation,apoptosis,and mobility of DDX51 siRNAtransfected cells were detected.The effect of DDX51 on the phosphoinositide 3-kinase(PI3K)/AKT pathway was investigated by western blot analysis.A mouse xenograft model was established to investigate the effects of DDX51 knockdown on ESCC tumor growth.RESULTS DDX51 exhibited high expression in ESCC tissues compared with normal tissues and represented a poor prognosis in patients with ESCC.Knockdown of DDX51 induced inhibition of ESCC cell proliferation and promoted apoptosis.Moreover,DDX51 siRNA-expressing cells also exhibited lower migration and invasion rates.Investigations into the underlying mechanisms suggested that DDX51 knock down induced inactivation of the PI3K/AKT pathway,including decreased phosphorylation levels of phosphate and tensin homolog,PI3K,AKT,and mammalian target of rapamycin.Rescue experiments demonstrated that the AKT activator insulin-like growth factor 1 could reverse the inhibitory effects of DDX51 on ESCC malignant development.Finally,we injected DDX51 siRNA-transfected TE-1 cells into an animal model,which resulted in slower tumor growth.CONCLUSION Our study suggests for the first time that DDX51 promotes cancer cell proliferation by regulating the PI3K/AKT pathway;thus,DDX51 might be a therapeutic target for ESCC.     

放射性肺纤维化基质重构与肌成纤维细胞凋亡抵抗的相关性

目的肌成纤维细胞(MFB)凋亡抵抗是肺纤维化进行性发展的关键原因,但MFB发生凋亡抵抗的机制尚未明确。MFB的状态与微环境-细胞外基质密切相关,而纤维化时细胞外基质呈现硬化、重构的特征。前期研究发现,体外3D拟基质不能诱导MFB凋亡抵抗。本研究通过制作去细胞基质(DM)而真实呈现肺基质结构特征,以探讨放射性肺纤维化(RIPF)基质重构与MFB凋亡抵抗的相关性。方法 C57BL/6小鼠全肺照射(总剂量18 Gy)形成RIPF模型;照射后2个月收取肺组织,采用化学加酶学方法制备DM;将分离获得的肺原代纤维细胞分别培养于不同组的DM切片上,TUNEL法比较细胞凋亡情况,组学技术比较转录水平的差异,Western印迹和免疫荧光法检测FAK,AKT和Bcl-2水平。结果 (1)小鼠胸部照射后2个月收集肺组织样本,免疫荧光染色显示,MFB(α-SMA+)表达Bcl-2增强,表现抗凋亡特征。(2) HE染色、电镜检测显示肺组织DM在体外重现肺纤维化基质紊乱、重构的原貌。(3)分别收集培养在正常组DM切片(C-DM)和RIPF组DM切片(RIPF-DM)上的肺纤维细胞,发现RIPF-DM上的MFB凋亡比例低于C-DM,活化胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3下调;KEGG通路富集发现,RIPF-DM可诱导MFB中PI3K-AKT-CREB通路水平上调。(4) Western印迹结果证实,RIPF-DM可上调pFAK/FAK,p-AKT/AKT和Bcl-2水平。结论 RIPF基质重构可诱导MFB凋亡抵抗,其机制与AKT通路上调有关。     

小鼠NLRP3基因腺病毒干扰载体的构建及功能鉴定

目的构建针对小鼠NLRP3基因的腺病毒干扰载体(Ad-NLRP3-shRNA),并在Min6和RAW264.7细胞中验证其基因沉默效率。方法针对小鼠NLRP3基因设计、合成3对NLRP3 shRNA 1-3干扰序列,重组至pHBAd-U6-CMV质粒载体。在HEK293T细胞内包装Ad-NLRP3-shRNA。感染Min6和RAW264.7细胞后,采用实时定量-聚合酶链式反应(RTQ-PCR)检测NLRP3基因表达。结果 Ad-NLRP3-shRNA 1-3在Min6和RAW264.7细胞的干扰效率分别达到44.38%、46.61%和82.83%以及47.23%、49.59%和78.64%。结论成功构建出Ad-NLRP3-shRNA载体,为研究NLRP3基因的功能提供有效工具。     

Survivin-shRNA对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞自噬及凋亡的影响

目的:研究Survivin-shRNA对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞自噬及凋亡的影响。方法:培养视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞，构建Survivin-shRNA载体。按照处理不同分为Survivin-shRNA组、GFP组和CON组。分别采用流式细胞术检测Survivin-shRNA对HXO-RB44细胞凋亡和细胞周期的影响，应用MTT法检测Survivin-shRNA对HXO-RB44细胞活性的影响，Western blot法检测Survivin-shRNA对HXO-RB44 细胞自噬相关蛋白LC3、p62 与mTOR 表达的影响。结果:流式细胞术结果表明，与Control组和GFP组相比，Survivin-shRNA组细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；随着作用时间的延长，S期出现阻滞，48 h阻滞最强，显著高于对照组（P＜0.05）。MTT结果发现Survivin-shRNA可抑制HXO-RB44细胞增殖活性，与Control组和GFP组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；Western blot结果发现，与对照组相比，LC3表达量显著增加（P＜0.01）；而mTOR表达量降低（P＜0.01）。结论:Survivin-shRNA可促进视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞的凋亡和自噬水平，进而特异性杀伤肿瘤细胞。     

lncRNA uc.48+对2型糖尿病大鼠肝糖原的影响

目的探讨长非编码核糖核酸uc.48+小干扰RNA(lncRNA uc.48+siRNA)对2型糖尿病大鼠肝糖原异常的影响及可能机制。方法采用高糖高脂饲料喂养及链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型,造模成功后,lncRNA uc.48+siRNA尾静脉注射至大鼠体内,动态监测血糖变化及注射1周后检测肝糖原含量;蛋白印迹及qPCR检测各组大鼠肝脏组织中葡萄糖激酶(glucokinase,GK)mRNA和蛋白表达变化。结果糖尿病模型大鼠用uc.48+小干扰RNA处理后,餐后血糖、空腹血糖较模型大鼠降低。肝糖原检测显示,糖尿病模型组大鼠肝糖原较对照组明显降低,糖尿病模型大鼠加uc.48+小干扰RNA处理后,肝糖原的合成较糖尿病模型组大鼠增多。糖尿病模型组肝脏GK mRNA和蛋白表达较对照组明显减少,经uc.48+小干扰RNA干预后,肝脏GK的mRNA与蛋白表达较糖尿病模型组明显增加。结论 uc.48+小干扰RNA可降低2型糖尿病模型大鼠升高的血糖,增加肝糖原合成,其机制涉及增加GK及磷酸化Akt1表达。     

全氟类化合物在人体与动物体内的生殖毒性

全氟类化合物（polyfluorinated chemicals，PFCs）是一类来自工业生产，存在于人们日常生活环境中内分泌干扰物（endocrine disruptors，EDCs）。研究表明，PFCs可以聚集在生物体内，并通过影响甾体激素合成、诱导生殖系统细胞凋亡、拮抗激素受体等机制，在生殖系统表现出毒性作用。在男性中，这类物质被证明与精子的质量与数量的下降及异常精子比率的上调有关，干扰男性性激素水平（如睾酮）；而在女性中也发现血液或卵泡液中PFCs水平的升高，往往伴随着性激素及促性腺激素（如雌孕激素，卵泡刺激素等）水平的异常以及生育力的下降，这类物质在孕期的暴露甚至有影响至下一代的可能。此外，已有动物实验从分子层面对这类物质的毒性机制进行了证实，因此PFCs的生殖毒性值得关注。     

基于PI3K/AKT信号通路的谷红注射液抗H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的机制研究

目的基于PI3K/AKT信号通路,探讨谷红注射液(guhong injection,GHI)对H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的保护作用。方法培养H9c2心肌细胞,CCK-8比色法筛选GHI实验剂量。将细胞随机分为8组:正常组、模型组、GHI低、中、高剂量组(30、60和90μL·mL^-1)、阳性药组(维拉帕米注射液7.5μL·mL^-1)、GHI+LY294002(PI3K抑制剂)组和LY294002组。除正常组外,其他组均建立缺氧4 h复氧16 h的H/R损伤模型。ELISA检测各组细胞内肌酸激酶同工酶(CKMB)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量,Western blot法检测各组细胞内p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT及GSK-3β蛋白表达水平。结果与模型组相比,各给药组LDH、CK-MB均降低(P<0.05),MDA降低(P<0.01)、SOD升高(P<0.01)。p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及GSK-3β蛋白表达水平均升高(P<0.01)。给予LY294002后,与模型组相比,LDH、CK-MB、MDA及SOD无显著性差异,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及GSK-3β蛋白表达水平均降低(P<0.01)。结论GHI可以明显减轻H/R对H9c2心肌细胞造成的损伤,表现出抗氧化应激与抗凋亡的作用,其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。