微小RNA-1266对钠通道蛋白表达和分布的影响

目的探讨心房颤动(AF)相关微小RNA-1266-5p(miR-1266-5p)与AF相关钠离子通道蛋白α亚基编码基因SCNA5的靶向调控关系。方法构建含有预测结合位点3'非翻译区(3'UTR)序列的靶基因,将其与阴性对照质粒以及miRNA共转染入人胚肾HEK293细胞,实验分为空白对照组、阴性对照组、实验一组(pc DNA3. 1-SCN5A 3'UTR改建质粒+miR-1266)和实验二组(pc DNA3. 1-SCN5A WT质粒,不含3'UTR端+miR-1266),荧光定量PCR法和Western blot法检测各组钠通道蛋白SCN5A mRNA和Nav1. 5蛋白表达变化,免疫荧光实验观察SCN5A Nav1. 5蛋白表达和分布变化。结果与空白对照组和阴性对照组比较,实验一组SCN5A mRNA表达分别下调49. 4%和46. 0%,差异有统计学意义(0. 557±0. 016 vs 1. 101±0. 132和1. 031±0. 020,P 0. 05),而实验二组SCN5A mRNA表达无显著变化(P 0. 05);实验一组SCN5A Nav1. 5蛋白表达下降,而实验二组SCN5A Nav1. 5蛋白表达无显著变化;实验一组和实验二组的SCN5A Nav1. 5蛋白分布都无显著变化。结论 SCN5A可能是miR-1266的直接靶基因,miR-1266可能通过负性调控SCN5A表达参与AF电重构。     

可视化血红素加氧酶-1小鼠模型用于药物肝毒性评价

目的 建立实时动态监测药物肝毒性小鼠模型,用于药物肝毒性临床前评价.方法 通过水动力高压转染法将表达萤火虫荧光素酶的血红素加氧酶-1(HO-1)报告基因质粒转染到小鼠肝细胞中,建立HO-1-Luc小鼠模型.使用HO-1-Luc小鼠模型动态监测对乙酰氨基酚(APAP)导致的肝损伤以及抗氧化剂谷胱甘肽对药物性肝损伤的治疗效果.结果 使用HO-1-Luc小鼠模型通过活体荧光成像的手段能监测到APAP引起的肝毒性,与通过活性氧相关标志物、转氨酶以及组织病理学等经典肝毒性检测手段得到的结果吻合.同时该小鼠模型能够监测到谷胱甘肽对APAP诱导的肝毒性保护作用.结论 建立的HO-1-Luc小鼠模型在药物临床前肝毒性评价中具有潜在应用价值.     

应用CRISPR/Cas9 系统敲除PD-1 基因对人T 淋巴细胞增殖及分泌IFN-γ 的影响

[摘要] 目的：探讨应用CRISPR/Cas9 基因编辑系统敲除PD-1 基因对人T 细胞增殖及分泌IFN-γ 的影响。方法：设计靶向PD-1 基因的sgRNA 序列，应用T7 RNA聚合酶体外分别合成PD-1-sgRNA 和Cas9mRNA。利用核转染技术将PD-1-sgRNA 和Cas9 mRNA混合物转入激活的人T淋巴细胞，测序确认基因敲除的效率。应用流式细胞术分析基因敲除后T淋巴细胞表型和PD-1 的表达情况,锥虫蓝活细胞计数法检测T 细胞增殖活力,ELISA 检测T 细胞分泌IFN-γ 情况。结果：体外成功合成PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA。将PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA核转染T淋巴细胞，测序证实PD-1 基因序列编辑效率为58.3%。CRISPR/Cas9 系统成功下调T淋巴细胞表面PD-1 分子的表达水平[ （9.6±1.85）% vs（16.2±2.05）%，P<0.05]，PD-1 基因敲除不影响T 细胞的增殖活力和细胞表型(P>0.05)；但PD-1-sgRNA 组的效应T细胞分泌IFN-γ 水平显著升高(P<0.01)。结论：CRISPR/Cas9 基因编辑系统成功敲除人T淋巴细胞PD-1 基因，降低PD-1 分子表达可阻断PD-1／PD-L1 负性调控从而增强T细胞的免疫活性，且促进效应T细胞分泌IFN-γ。     

体外转染Cyclin A2基因对原代大鼠心肌细胞增殖的影响

目的探讨体外转染细胞周期素A2(Cyclin A2)基因对原代大鼠心肌细胞增殖的影响,为心脏再生提供细胞学依据。方法 SD乳鼠12只,分离、培养、鉴定原代乳鼠心肌细胞并分为3组,实验组:转染带有强化绿色荧光蛋白(GFP)和Cyclin A2基因的重组腺病毒(Ad-Cyclin A2-GFP);空病毒组:转染不含目的基因带有GFP的重组腺病毒(Ad-Null-GFP);阴性对照组:未做转染处理,仅加入等量的培养基。利用GFP示踪技术,评估原代心肌细胞转染效率;转染后的细胞继续体外培养3~5d,利用免疫荧光技术分别检测Cyclin A2、磷酸化组蛋白H3(H3P)、心肌肌钙蛋白-T(c Tn T)。结果 1.荧光GFP示踪表明原代心肌细胞的转染效率高达(97±0.74)%;2.免疫荧光标记显示,空病毒组和对照组结果相似;心肌细胞特异性标记蛋白c Tn T分布于细胞质,原代心肌细胞纯度高达(95±0.62)%;心肌细胞Cyclin A2主要在胞核内聚集,少数分布于细胞质。H3P为核蛋白在细胞核内分布。3.转染Cyclin A2后,实验组H3P阳性率明显高于空病毒组和对照组,差异具有统计学意义(P0.05);实验组可见大量多核细胞,以双核为主,伴少量3核细胞。结论腺病毒作为转染载体对原代心肌细胞有很好的侵染效率;Cyclin A2超表达促进原代心肌细胞形成双核。     

NRAGE影响人食管癌细胞放射抗性的作用及其机制研究

背景与目的：食管癌是全球威胁人类生命和健康的常见恶性肿瘤之一，中国每年食管癌发病人数占全球发病总人数的一半以上，以食管鳞癌最为常见。放疗是食管癌三大治疗手段之一，而放射抗性是导致其治疗失败的主要原因。神经营养因子受体相互作用MAGE类药物（neurotrophin receptor-interacting MAGE homolog，NRAGE）在放射抗性细胞株TE13R120中表达量明显高于亲本TE13细胞，且NRAGE亚细胞定位变化可能参与食管癌细胞放射抗性的形成。通过基因转染构建NRAGE稳定表达的食管癌细胞系，以进一步明确NRAGE基因与食管鳞癌细胞放射抗性的关系，分析该基因影响放射抗性的具体机制。方法：通过基因转染构建NRAGE稳定表达的食管癌细胞系。采用细胞克隆形成实验检测细胞放射敏感性，采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡；细胞划痕、Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力，采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitive polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞中β-catenin表达情况。组间差异采用t检验或方差分析。结果：实验分为转染过表达组（Eca109/NRAGE组）和空白对照组（Eca109组）。Eca109/NRAGE细胞中NRAGE的表达量明显高于Eca109（t=29.65，P<0.05）。照射后Eca109/NRAGE细胞的放射抗性显著高于Eca109。流式细胞术检测结果显示，Eca109/NRAGE细胞中对射线抵抗性最强的S期细胞比例增加，对射线最敏感的G ₂ /M期减少。Eca109/NRAGE细胞凋亡率较Eca109细胞降低（t=3.268，P<0.05）。Eca109/NRAGE细胞迁移和侵袭能力均高于Eca109。RTFQ-PCR和Western blot检测结果显示，β-catenin的mRNA表达及蛋白水平在Eca109/NRAGE细胞中明显高于Eca109（t=15.87，P<0.05）。结论：NRAGE参与Eca109细胞放射抗性的形成，改变细胞的细胞周期分布和凋亡情况，影响细胞迁移及侵袭能力并可能影响食管癌细胞的放射敏感性，该作用可能与激活Wnt/β-catenin信号转导通路有关。     

血管内皮生长因子基因修饰诱导多能干细胞的生物学特性的研究

目的 探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因修饰诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的生物学特性。方法 将培养好的iPS细胞分为3组,即N0(纯iPS培养)组、N1(空腺病毒载体转染iPS)组、N2(转染VEGF基因的iPS)组; 3组细胞分别进行传代培养,并采用MTT方法检测转染VEGF基因对细胞增殖的影响; 采用酶联免疫(ELISA)方法检测细胞培养上清液中VEGF的表达水平。结果 转染VEGF基因对iPS细胞增殖没有明显影响; N2组iPS细胞分泌的VEGF蛋白表达水平较N1组显著增加(P<0.05)。结论 经VEGF基因转染的iPS可正常存活生长,并可稳定表达该基因。     

pT67M54稳定单克隆细胞株（系）的建立

将一个拟定的目的重组基因构建转染进入一个具有优异品质的包装细胞，建立组合特定目的基因载体的独一无二的稳定单克隆细胞株(系)是一项极为艰苦、富有挑战而又非常重要的工作。根据研究的需要，我们选择和决定将经过一再测试已成功表达的新构建质粒pM54转染进入pT67细胞以建立能生产逆转录病毒(含特异启动子及目的基因)的稳定单克隆细胞株(系)。     

转染BMP-II型突变受体基因对Tca8113舌癌细胞增殖的影响

目的：明确转染BMP-Ⅱ型突变受体对Tca8113舌癌细胞的作用，以进一步探讨BMPs对口腔上皮恶变的作用机制。方法：用FuGENll6(Transfection Reagent Kit)真核转染试剂盒将携带BMP-Ⅱ型突变受体cDNA的真核表达载体转染Tca8113细胞(命名为Tca8113ZR细胞)；然后对Tca8113ZR和Tca8113细胞分别进行生长曲线、MTT检测，FCM分析，BrdU标记检测细胞的增殖活性及DNA合成；以观察转染前后舌癌细胞生物学性状的变化。结果：Tca8113ZR细胞和Tca8113细胞相比，形态未见明显变化，但是细胞的增殖活力明显下降。结论：BMPs信号表达水平的改变在口腔上皮组织的恶变过程中起着十分重要的调控作用。     

骨形成蛋白2基因转染的人牙周膜成纤维细胞的骨诱导作用

目的　建立表达骨形成蛋白2 (BMP-2)的人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs),观察其体内成骨作用,为牙周缺损修复基因疗法的建立提供实验依据。方法　采用脂质体载体将人BMP-2噬菌粒表达载体pBK-B2转染至 HPDLFs。利用免疫组化ABC法检测转染细胞内BMP-2蛋白的表达,并于无菌条件下将转染细胞注射于裸鼠股部肌肉内,21 d后取材,苏木精-伊红染色观察肌肉组织内骨形成情况。结果　BMP-2基因转染后HPDLFs内有BMP- 2蛋白的表达。在注射BMP-2基因转染细胞的肌肉组织内可见明显的新骨形成。结论　BMP-2基因成功转入HP- DLFs中并得到有效表达,转染BMP-2基因的HPDLFs能够在体内诱导新骨形成。     

p53基因抑制涎腺腺样囊性癌细胞端粒酶及增殖活性

目的研究外源性野生型p53基因对涎腺腺样囊性癌细胞的抑制作用。方法构建携带野生型p53基因的腺病毒表达载体，以脂质体法转染涎腺腺样囊性癌SACC-83细胞，RT-PCR检测p53基因表达；采用TRAP—PCR—ELISA法检测转染细胞端粒酶活性，荧光素酶分析法检测人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）肩动子的转录；流式细胞术、软琼脂集落实验及裸鼠成瘤实验观察细胞生物特性的变化。结果外源性野生型p53基因导入使p53基因在涎腺腺样囊性癌细胞SACC-83中表达增强，其端粒酶活性降低、hTERT启动子转录抑制；转染细胞出现G1期阻滞，软琼脂集落形成率减少，裸鼠成瘤能力降低。结论腺病毒载体介导的外源性野生型p53基因可以抑制涎腺腺样囊性癌细胞端粒酶活性及细胞恶性表型。