应用基质辅助激光解吸质谱的源内衰变及串联质谱技术测定重组人纽兰格林的C端序列

目的测定重组人纽兰格林的C端序列。方法用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI—TOF-MS）的源内裂解（ISD）及串联质谱技术（TOF—TOF,LIFT）,测定重组蛋白纽兰格林的C端序列。结果用该方法鉴定了重组蛋白纽兰格林C端序列的10个氨基酸残基。结论与现有的C-端序列测定方法比较,该方法简便快捷,可适用于部分重组蛋白药物的质量控制。     

重症肌无力患者FOXP3表达变化与体液免疫异常的相关性

目的 探讨重症肌无力(MG)患者外周血叉头样转录因子P3(FOXP3)表达变化与体液免疫异常的关系.方法 利用RT-PCR技术检测41例MG患者和20名体检健康者外周血单个核细胞FOXP3、B淋巴细胞激活因子(BLyS)、补体调节因子膜反应性溶解抑制物(CD59)和衰变加速因子(DAF)的mRNA表达,用ELISA法检测外周血清转化生长因子(TGF-β1)、抗乙酰胆碱受体抗体(anti-AChR-IgG)水平,并进一步分析其间的关系.结果 (1) MG患者组外周血FOXP3、CD59、DAF的mRNA表达及血清TGF-β1水平明显低于健康对照组,BlyS mRNA表达水平明显高于健康对照组(均P<0.01);(2)外周血FOXP3、BLyS、CD59、DAF的mRNA表达及血清TGF-β1水平,在眼肌型与全身型MG患者间差异无统计学意义;(3)41例MG患者中血清抗AChR-IgG阳性30例,眼肌型(18例)和全身型(12例)血清抗AChR-IgG水平差异无统计学意义(P＞0.05);(4)MG组外周血单个核细胞FOXP3 mRNA表达与血清TGF-β1水平及CD59、DAF mRNA表达水平呈正相关(分别r=0.84, P<0.01;r=0.455, P<0.05;r=0.435, P<0.05),与BLyS mRNA表达呈负相关(r=-0.58, P<0.05);血清抗AChR-IgG抗体阳性患者中,抗AChR-IgG抗体水平与FOXP3 mRNA表达水平、血清TGF-β1水平呈负相关(分别r=-0.77、r=-0.81, 均P<0.01),而与BLyS mRNA表达水平呈正相关(r=0.757,P<0.01),与CD59、DAF mRNA水平无相关性(P>0.05).结论 FOXP3 mRNA、TGF-β1低表达可能促进B细胞活化,进而通过增加AChR抗体产生及抑制补体调节蛋白活化促进体液免疫,在MG发病中起重要作用.     

衰变加速因子及其所在膜微区在T淋巴细胞信号传递中的作用

低温抽提Jurkat细胞膜去污剂抗性的膜成分(DIG),检测Src家族酪氨酸激酶(PTK)及衰变加速因子(DAF)的分布情况。共聚焦扫描显微技术检测Jurkat细胞静息与交联状态下DAF分子对去污剂Triton-X100的抗溶性,以探讨其在Jur-kat细胞免疫识别中的作用,结果显示静息状态CD3对去污剂无抗溶性,而DAF与Lck有抗溶性。单抗交联后CD3对去污剂抗性有所增加。静息状态DAF与Src家族PTK特异分布于膜微区中,交联CD3可诱导CD3与膜微区特异性聚集,DAF所在的膜微区可能促进T细胞的免疫识别和信号传递作用。     

促衰变因子的研究进展

近年来，国外对促衰变因子（ＤＡＦ）的研究非常活跃，本文综述了ＤＡＦ的分布及形成，生物化学、分子生物学表达调控及临床应用。相信不久的将来，在人类器官的移植中，ＤＡＦ将发挥巨大的作用。     

CR2-DAF和DAF-CR2靶向补体抑制物的构建、表达与鉴定

目的: 构建针对补体激活物的特异靶向补体抑制物, 并对其进行体外活性鉴定.方法: 将补体受体(CR2)与补体抑制物(促衰变因子, DAF)以融合表达方式(顺反结构)克隆到表达载体PBM中, 然后将重组体转移到CHO细胞中进行蛋白表达, 用SDS-PAGE、 Western blot、流式细胞术(FCM)检测、 SPR检测及补体介导的细胞溶解实验对表达的融合蛋白进行生物学活性鉴定.结果: SDS-PAGE和Western blot结果显示出现预期大小的目标片段.FCM与SPR检测结果显示, 重组蛋白CR2-DAF与DAF-CR2能特异地与C3包被的CHO细胞、 C3dg配基相结合.补体介导的细胞溶解实验结果显示, 靶向补体抑制物比相应的非靶向补体抑制物的抑制效果明显(CR2-DAF的抑制效率高达20倍).结论: 成功构建了CR2-DAF和DAF-CR2靶向补体抑制物, 为下一步进行动物体内补体抑制实验奠定了基础.     

人衰变加速因子基因在猪血管内皮细胞中的表达

目的 通过转基因方法使猪的血管内皮细胞表达人DAF蛋白，抑制猪供人移植超急性排斥反应。方法 体外培养猪腹主动脉内皮细胞，用透射电镜方法进行鉴定。脂质体转染法将含有人DAF基因的真核表达载体PSFFV－DAV转染进猪的血管内皮细胞，经G418筛选（浓度为100mg/L)12d，获得具有抗性的克隆，进而增殖，传代，保种。通过流式细胞仪检测转染细胞DAF的表达情况。结果 转染了基因的细胞与未转染基因的细胞在流式细胞仪检测中其莹光强度分别为82.18和1.69。转染的细胞5代后其荧光强度为71.96。结论 转染了人DAF基因的细胞荧光强度明显高于对照组。导入的外源基因在细胞内能高效、稳定地表达，为转基因猪的建立奠定一定的基础。     

DAF与CD3协同刺激人外周血T细胞活化的实验研究

目的：探讨人促衰变加速因子（decay-accelerating factor,DAF)作为共刺激分子参与T细胞活化的作用机制。方法：观察3株针对DAF不同SCR的单抗单独使用或者与抗人CD3单抗联合使用时，对人外周血T细胞增殖、IL－2分泌以及胞浆Ca^2 水平的影响。结果：所用3株抗人DAF单抗不能活化T细胞，而抗人DAF单抗与抗人CD3单抗可以协同刺激T细胞增殖，促进IL－2分泌以及提高胞浆Ca^2 水平。结论：抗人DAF单抗与抗人CD3单抗可协同刺激人外周血T细胞活化。     

人衰变加速因子DAF基因真核表达系统的构建

目的：构建含人补体调节蛋白衰变加速因子DAF分子的cDNA编码区的真核重组表达载体pcDNA3-DAF,转染NIH3T3细胞,建立稳定表达人DAF的NIH3T3细胞模型。方法：将人DAF分子的cDNA编码区克隆到真核表达载体pcDNA3,经酶切和测序鉴定后用磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NIH3T3细胞株。用PCR检测人DAF基因在NIH3T3细胞基因组中的整合;用RT-PCR、Westernblot实验和间接免疫荧光技术分别从RNA水平和蛋白质水平检测人补体调节蛋白分子DAF在细胞株中的表达。结果：成功构建了pcDNA3-DAF重组真核表达载体,并建立了稳定转染的NIH3T3细胞株,成功地表达了目的基因。PCR检测连续传代30次的NIH3T3pcDNA3-DAF细胞,结果显示人DAF基因仍稳定整合在异源细胞的染色体上,并未随着传代而丢失,为稳定的转染细胞株。结论：真核表达载体构建和稳定转染NIH3T3细胞株的建立为进一步研究人DAF功能和多种补体调节蛋白的协同作用奠定基础。     

补体经典激活途径C3转化酶的体外组装及活性观察

目的：体外组装包含人C4分子的补体经典激活途径C3转化酶，并对其转化酶活性及衰变特性进行观察。方法：利用豚鼠血清功能纯C1、C2及溶血中间体EAC4^hu体外组装经典途径C3转化酶，观察不同C1、C2用量及孵育温度对C3转化酶形成和自发性衰变的影响，以及人红细胞膜抽提蛋白对C3转化酶衰变化的影响。结果：高剂量和低剂量的C1均会影响C3转化酶的形成，增加C2用量可增加C3转化酶的形成数量，C3转化酶的自发性衰变随孵育温度的升高而加速，人红细胞膜抽提蛋白可抑制C3转化酶的自发性衰变过程，结论：C1、C2用量及孵育温度是影响C3转化酶形成和自发性衰变的主要因素，体外组装的补体经典激活途径C3转化酶可应用于相关补体调控蛋白的活性检测。     

白细胞介素4对重症急性胰腺炎大鼠补体调节因子的影响

本研究将白细胞介素4 (IL 4 )应用于重症急性胰腺炎(SAP)大鼠模型,观察其对膜辅助蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)和膜反应性溶解物抑制物(CD5 9)表达的影响及疗效,为SAP的治疗提供新的思路。材料与方法1.SAP模型的建立及实验动物分组:健康Wistar大鼠6 1只,体重2 0 0～2 5 0 g ,雌雄不拘,采用胆胰管内逆行注射法制作SAP模型。随机分为A组(2 1只) ,制作SAP模型后不给予任何治疗;B组(2 0只) ,制作SAP模型前0 5h给予IL 4 (英国peprotech公司产品,货号为4 0 0 0 4 )腹腔内注射,剂量为8μg/只[1] ;C组(2 0只)制作SAP模型后0 5h给…